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龙军真菌讲稿4
分子生物学技术
台湾学者运用液相芯片技术，基于所有真菌的高度保守序列如18S、28S和高度可变的内部转录间隔区(ITS) ，前者用于筛选真菌感染，后者用于菌种的确定，同时对64种真菌进行鉴定，敏感性和特异性均大于97疗效
药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效
药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效
NCCLS对药敏结果的解释
MIC不是一个物理或化学的指标
• 在实际临床治疗中，宿主因素往往比药敏试验结果更为重要
• 体外药敏结果敏感并不预示治疗成功
• 体外的耐药常预示治疗失败
产孢丝状真菌抗真菌药敏试验NCCLS方案 M38－A简介
M38-A，微量肉汤稀释法适用于曲霉属、镰刀霉属、结合菌、赛多孢属、孢子丝菌等丝状真菌。
• 该方案仅对试验条件和判读标准进行
了统一，并没有给出M IC的判定折点
药敏判读
在终点判读时，将伊曲康唑由原方案的５０％生长抑制改为１００％生长抑制，即读数为０时的最低药物浓度• 新型三唑类药物的MIC值定义也是如此• 原因是伊曲康唑和其他新型三唑类药物，与***康唑和***康唑不同，判读终点时不存在拖尾• 质控菌株增加了：-黄曲霉ATCC204304-烟曲霉ATCC204305
药敏判读
丝状真菌对***霉素B 的M IC -2 mg/L,但是部分真菌(如:土曲霉、枝顶孢霉、尖端赛多孢霉、足分支霉) MIC 可能超2mg/L。一般认为,MIC >2 mg/L,***霉素B治疗有可能失败。• 丝状真菌通常对5-FC和***康唑不敏感,MIC往往大于64 mg/L。
丝状真菌常侵袭组织, MIC和药物组织浓度的关系对于临床治疗指导意义更大
药敏判读
因此,目前对于丝状真菌的体外诊断,更有意义的不是药敏试验,而是仔细地将致病真菌鉴定到种• 举例说明:如果分离到土曲霉、尖端赛多孢霉、足分支霉,就知道这些真菌通常对***霉素B耐药
纸片扩散法
将含有一定量抗真菌药物的纸片置于接种有一定量真菌的平皿中，在一定的温度经过一定时间孵育后，通过测量抑菌圈的大小来判断受试真菌对于该药物的敏感性• 该方法简单直观，已有商品化• 缺点：不能精确量化
酵母菌纸片扩散法敏感试验 (CLSI)M44-P
M44-P 酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，制定了***康唑(fluconazole)和沃尔康唑(voriconazole)质控株的参考范围及***康唑的抑菌环解释标准
研究证实***康唑对酵母菌药敏试验有较好的重复性，可准确地检测酵母菌对***康唑的敏感性
ROSCO 酵母菌纸片扩散法
改良Shadomy琼脂或RPMI 1640琼脂加热溶解后倒入9cm平皿（20ml） 新鲜具活力的纯化的酵母菌落以生理盐水制成5*105FU/ml() 接种：平皿先置35℃干燥20－25分钟，，均匀涂布，用移液管吸除多余的菌液35℃干燥15分钟后贴上药物纸片 培养：35℃ 18－24小时，如未见明显生长，再放24小时。隐球菌：30℃ 42－48小时
结果判读
***康唑、***康唑、***胞嘧啶：
≥20mm 敏感 12-19mm 中介≤11 耐药
***霉素B 、伊曲康唑、制霉菌素:
≥15mm 敏感 10-14mm 中介
无抑菌圈 耐药
E-test法
是一种商品化的抗真菌药物敏感性方法
采用被不同量的抗真菌药物包被的特殊试
剂条，受试药物包括***康唑、伊曲康唑和
***霉素B等
• 该方法操作简单、直观，与NCCLS法有较好
的一致性
• 缺点：结果判定需有一定经验，价格昂贵
E-test法
基本原理：用特殊技术将抗菌药物在一试剂条上形成一个定量连续梯度,其培养基、菌接种浓度、培养温度及时间等条件基本按照M-27方案所推荐的条件E-test法已被用于某些霉菌如曲霉属、镰刀菌属和根霉属的药敏检测
E-test法
E-test抗真菌药敏试条：• 二性霉素B(AP)• 5***胞嘧啶(5-FC)• ***康唑(KE)• 伊曲康唑(IT)• ***康唑(FL)• 起始浓度:32mg/L终末浓 度:
丝状真菌的E-test药敏试验
流式细胞检测法
原理:检测不同药物浓度作用下各药物浓度管的荧光强度，根据荧光强度的梯度变化趋势，判定药物抗菌活性的一种方法
对流动液体中排列成单列的细胞和颗粒进行检测，分析其光散射和荧光，从体积、内部结构等物理及化学特征判断真菌活力和功能状态。
深部真菌感染存在的问题—总结
真菌广泛定殖于人体的各个部位及存在于周围环境中，在免疫缺陷者引起感染。
临床医师诊断困难：没有典型症状和体征
缺乏良好的检查方