生物化学实验方案.doc

Marker 做琼脂糖凝胶电泳,发现 Marker 在加样孔有一个明显的亮带,什么原因? 参考见解: marker 有时会出现这样的问题, 应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白, 有时 DNA 提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 时, 跑出的带后面出现拖尾现象, 什么原因造成的? 参考见解: DNA 带模糊??: 1、 DNA 降解?? 避免核酸酶污染。 2、 DNA 上样量过多?? 减少凝胶中 DNA 上样量。 3、所用电泳条件不合适?? 电泳时电压不应超过 20V/cm , 温度< 30℃, 巨大 DNA 链, 温度应< 15℃,核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、 DNA 样含盐过高?? 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 5、有蛋白污染?? 电泳前酚抽提去除蛋白。 6、 DNA 变性? 电泳前勿加热,用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA 。将从组织提取的 DNA 进琼行脂糖凝胶电泳,用的 % 的胶加了 EB, 80V 跑1 小时,溴酚蓝已经跑到头了,在紫外灯观察什么带也没有,只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来, 是怎么回事? 参考见解: 1 、根据目的条带长度来调整凝胶浓度,一般 %左右,也不一定。 2 、紫外灯下没见带,不一定没有出孔,而是量少看不到,可以测一下浓度看一下,或直接试跑一下 PCR 。 3、最好加一个 marker 孔,尤其你第一次跑胶时。 4、电泳时间可能过长, 一般 75v × 30min 左右, 但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。在 的 TBE 缓冲液中进行质粒( DNA ) 的琼脂糖凝胶电泳时质粒向哪一极运动, 为什么? 如在 DNA 样品中加足够的亚精氨后再电泳会发生什么现象,为什么? 参考见解: 1、 DNA 分子在碱性凝胶缓冲液中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。 2 、样品中加足够的亚精氨后, 亚精***头部的强阳极性使整个分子高度亲和于 DNA , DNA 与碱性亚精***结合, 结合分子带阳离子。 DNA 电泳的 MARKER 怎么是扭曲的? 参考见解: 1 、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的. 最好是同时配制. 电泳时缓冲液高过液面 1- 2mm 即可。 2 、电泳时电压过高, 可以在电泳前 15 分钟用较低电压(3V/cm), 等条带出孔后比较漂亮了. 然后再调电压。 3、上样时尽量慢慢加样, 等样品自然沉降后再加电压。跑出的 DNA 带模糊? 参考见解: 1、 DNA 降解:避免核酸酶污染。 2 、电泳缓冲液陈旧: 电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低, pH 值上升,缓冲能力减弱, 从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 3 、所用电泳条件不合适: 电泳时电压不应超过 20V/cm ,温度< 30℃;