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上海交通大学博士学位论文- 66 - 第五章硝基精氨酸手性转化和立体选择性代谢的关系手性药物在体内代谢的过程中不同的异构体会在体内分布体内代谢转运速度蛋白结合率及清除速率方面存在差异大量的文献表明氨基酸类化合物在药物代谢动力学过程中表现出立体选择性作为天然氨基酸精氨酸的衍生物硝基精氨酸的单向手性转化预示着该化合物体内代谢异构体选择性差异的存在 Wang等在麻醉大鼠体内证实了这种差异的存在 Wang et al., 1999 但是因为麻醉状态下动物对药物的代谢与正常状态时不甚相同为此本文将应用清醒大鼠考察体内硝基精氨酸的手性药代动力学另一方面虽然苯丙氨酸在人体内(Lehamann et al., 1983)和亮氨酸在大鼠体内(Hasegawa et al., 2000)的单向手性转化和药动学立体选择性差异先后被证实但是对于氨基酸手性转化与异构体代谢差异之间的关系一直无研究探讨本文也对硝基精氨酸手性转化和代谢动力学的关系进行了研究在前期实验考察D型氨基酸氧化酶D-amino acid oxidase, DAAO 在D-硝基精氨酸(N G-nitro-D-arginine, D-NNA )手性转化中所起作用时我们发现DAAO的选择性抑制剂苯甲酸钠 400 mg/kg可完全消除大鼠对D-NNA在升压反应但不影响大鼠对L-硝基精氨酸(N G-nitro-L-arginine, L-NNA )的升压反应因此我们认为苯甲酸钠可能影响了D-NNA的手性转化甚至代谢过程利用苯甲酸钠可在体内有效抑制DAAO生物活性这一性质本研究应用毛细管电色谱capillary electrochromatography, CEC 对苯甲酸钠在硝基精氨酸的手性转化和代谢动力学的影响进行考察希望能揭示硝基精氨酸单向手性转化和代谢立体选择性差异之间的关系 D-硝基精氨酸体内手性转化机制的研究- 67 - 1材料和方法 药物和主要试剂 D-NNA (吉尔生化上海有限公司上海) L-NNA和天门冬氨酰苯丙氨酸甲酯(aspartame) (Acros, 比利时) 其余试剂均为国产分析纯 D-NNA和L-NNA均溶解于5%的葡萄糖注射液溶度分别为8 mg/ml和4 mg/ml 完全溶解需要至少20 min的超声 仪器与设备 CEC美国通微分析技术有限公司 C 18反相毛细管柱75 ìm . ×25 cm (上海通微分析技术有限公司) 动物 SD大鼠? 250 ~300 g购自中国科学院上海实验动物中心 大鼠体内D-NNA的药代学实验 SD大鼠给予戊巴比妥钠(65 mg/kg, ip)麻醉在左上缘大腹股沟切口分离股静脉实施股静脉插管聚乙烯PE50管美国Becton Dickinson公司术 PE50管经背部皮下从颈背部引出将导管内充满肝素液 200 U/ml 缝合切口术后大鼠独笼饲养恢复24 h 插管大鼠随机分为四组两组给予5%的葡萄糖注射液(4 ml/kgn = 10)另外两组给予苯甲酸钠400 mg/kg, n = 10 20 min后大鼠再分别给予D-NNA32 mg/kg, n = 10或L-NNA16 mg/kg, n = 10 所有的药物均通过插管给予每次给药后给予600 ì h采血200ìl置肝素管内离心制备血浆-20 ?备用每次采血后通过插管推注200 ìl的生理盐水补充血容上海交通大学博士学位论文- 68 - 血浆D/L-NNA的CEC检测 100ìl血浆样品以10倍体积甲醇/***(V/V=1:1)沉淀蛋白10000 r/min离心15 min 上清液用离心浓缩仪挥干用100 ìl醋酸缓冲液()溶解为样品液应用前期试验所优化CEC手性配体交换法进行血浆内D/L-NNA的手性药物检测具体方法见第二章 数据处理应用药代动力学软件DAS (皖南医学院)中非房室模型对所获得的血药浓度- 时间数据进行拟合得出相关药代动力学参数 D-NNA向L-NNA的手性转化率F D-NNA?D-NNA用下面这个公式来计算其中AUC Area Under Curve应用梯形法计算Pang and Kwan, 1993; Hasegawa et al., 2002 F D-NNA?L-NNA= L-NNA由D-NNA代谢生成量 D-NNA给药量 = CL DL·AUC D-NNA Dose D-NNA (1) 其中CL DL为D-NNA代谢为L-NNA的清除率AUC D-NNA为D-NNA的AUC 按照物质守恒原则体内转化而来的L-NNA的变化为转化来L-NNA的变化= CL DL·C D-NNA - CL L