体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞.pdf

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞专业:病理生理学博士生:彭延文指导教师:李树浓教授摘要胚胎干细胞(embryonicStemcell,ESC)又称多能干细胞,是由受孕3—5天的囊胚内细胞团经体外抑制分化培养所得的一种高度未分化细胞,具有无限增殖和多向分化的潜能。去除分化抑制因子后,悬浮的ES细胞可分化为具有三个胚层细胞的类胚体(embryoidbody,EB),在适宜的条件下,还可诱导分化为多种成体细胞,如肝细胞,心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞和各种血细胞等。因此,可以通过ES细胞建立体外分化模型,研究胚胎早期发育的分子和细胞机制,不同基因或细胞因子在对不同类型细胞或组织分化的作用,以及作为移植疗法的“种子”细胞治疗各种疾病[卜2]。尽管ES细胞可以在体外分化成绝大多数血液细胞,如白细胞、红细胞和B淋巴细胞等,但试图诱导ES来源的造血干细胞体外分化为T细胞进展缓慢。T细胞是构成机体免疫系统重要的细胞成分,自45年前Miller发现胸腺是重要的免疫器官[3]以来,免疫学家不断致力于研究胸腺在造血干细胞分化发育成T淋巴细胞过程中所起的作用。现有的研究结果表明:T细胞在胸腺内的发育过程是一个复杂的过程,需要胸腺提供适合T细胞发育的细胞和体液微环境。因此,在造血干细胞向T细胞分化的过程中,始终必需依赖胸腺器官培养体系提供胸腺微环境。直到2004年由加拿大多伦多大学的Zuniga-Pflucker和他的同事利用转染了Notch配体Delta-Iike-1的基质细胞系OP-9,首次不依赖胸腺器官培养体系在体外诱导出成熟的有功能的体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞T细胞[4]。Notch信号是控制多种细胞和组织分化发育的信号途径,现在的许多研究都肯定了Notch分子及其配体决定T细胞的发育,胸腺微环境通过调节Notch信号影响T细胞的发育[5-8]。以往对胸腺的研究主要集中于胸腺基质细胞与T淋巴细胞间的相互作用[9—12],现在的研究表明胸腺体液微环境,包括多肽分子和细胞因子在T细胞发育过程中也起着重要作用[13一l6]。临床已广泛使用胸腺多肽治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、各种免疫缺陷病、乙型肝炎和其它免疫功能异常所致疾病,胸腺肽、胸腺素a1(日达仙)和胸腺5肽是目前临床使用最多的几种调节免疫功能的药物,并已取得了肯定的临床治疗效果[17-22]。它们发挥作用的机理尚未研究清楚,药理学研究提示其能促进T细胞成熟,增强外周成熟T细胞的功能,但如何促进T细胞的成熟,及其在T细胞胸腺发育的早期的作用研究的较少,究其原因可能是以往的研究模型无法避免外源性胸腺细胞和多肽的影响。本研究利用去除抑制细胞分化的白血病抑制因子(1eukemiainhibitorfactor,LIF)后,悬浮的ES细胞可自然分化形成具有三胚层细胞的类胚体,5—7天后加入诱导分化的细胞因子和三种不同的胸腺多肽,试图研究这些胸腺多肽是否影响早期T细胞发育。实验分为四组:对照组加入干细胞因子(stemce11factor,SCF),白细胞介素一3(interleukn-3,IL-3),白细胞介素一7(interleukin-7,IL-7),Flt3配体(Flt3L)。实验组1在对照组的基础上加入胸腺5肽;实验组2在对照组的基础上加入日达仙;实验组3在对照组的基础上加入胸腺肽。分别在诱导后·周、两周和三周后利用流式细胞仪检测诱导的细胞表型变化。结果显示加入日达仙和胸腺肽的实验组在第二周出现T细胞特异性的CD3分子的表达,CD3+细胞随诱导时间的延长而增加。而加入胸腺五肽的实验组和对照组一样,均未检出CD3+细胞。因此,结果提示日达仙和胸腺肽可能通过影响T细胞胸腺发育期而对机体的免疫系统起调节作用。体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为T淋巴细胞样细胞本研究中,我们分别收集诱导分化后第8天、第l5天和第22天的胚体,抽取RNA,DNA酶消化后经RT-PCR检测Notchl及其配体Jaggedl,Jagged2,Delta-iike-l和Delta-1ke-4的转录水平。结果显示对照组和加入胸腺五肽的实验组的RNA均无Notch信号的转录,只有加入胸腺素a1和胸腺肽的实验组有Notchl分子及其配体Delta-1ike-1和Delta-1ike-4的转录,而且随着诱导时间的延长,Notchl,Delta-1ike-1和Delta-1ike-4的转录水平不断增强,与已有的研究结果相符。由于两种胸腺多肽对T细胞发育的影响相似,且胸腺肽主要含胸腺素Q1和一些小分子多肽,日达仙是化学合成的胸腺素Q1,因而我们选择日达仙作为诱导因子进一步研究其对T细胞发育的作用。T细胞在胸腺发育期会出现CD25和CD44分子的变化和表达T细胞特异性的CD3,C