shRNA详细设计教程-以pLKO.1-Puro为载体设计.docx

shRNA设计
此教程用于不知道siRNA靶点的设计,从文献中选择序列,可以从第5步开始设计

例如 Gene Name: TP53 Accession:
2. 寻找靶点
http://rnaidesigner./rnaiexpress/?designOption=shrna&pid=-7168952604080645646
输入基因序列号,或者粘贴序列
点击 RNAi设计

(选择星号比较多的2-3个作为目的序列)

点击设计shRNA OLigos
网页上的loop 可以不更改(后面需要更改为常用loop序列TTCAAGAGA)
点击设计
设计好的序列如下(上面是以thermo的载体(pENTR™/U6)设计)

(-puro设计,酶切位点AgeI EcoRI,酶切位点后1300bp有一个单一的酶切位点KpnI)
注意:shRNA比较短,而且结构复杂,测序困难,选择载体上的单一酶切位点,设计到shRNA里面,用于后续的单酶切验证
设计模板按照下图
(下图去除AgeI和EcoRI,也可以适当位置添两个碱基保留着两个酶切位点)
5’-CCGG siRNA正向序列 TTCAAGAGA 反向互补序列TTTTTT -3’
3’- 正向互补序列 AAGTTCTCT 反向序列 ATGG TTAA-5’
将网页上设计的shRNA 序列替换到上述模板
替换之后如下
5’-CCGG AGAATGCAAGAAGCTTTTTT -3’
3’- ATGG TTAA-5’
注意:正义链为5’→3’,反义链为3’→5’,合成时需要进行反向处理。

二级结构(用DNAMAN分析二级结构)
分析正反向引物是否匹配
用Snapgene 分析,正向序列输入进去,反向的作为引物用来验证(注意5’ 3’方向)
一个正确的shRNA应该入下图

5’-CCGG AGAATGCAAGAAGCTTTTTT -3’
5’- AGAATGCAAGAAGC -3’

shRNA对引物纯度要求不高,不需要用page纯化,为了节约成本,用低一级的纯化方式HAP
即可使用。

稀释到50uM
,加1ul,退火buffer(可以用不含dNTP和酶的PCR buffer),95℃ 3min,自然降温到室温。
将载体酶切尽可能保证载体全部双酶切切开,可以选择NEB没有星活性的的酶。
取1ul 退火后的溶液,与载体(20-50ng就够了)连接并转化。

如果有载体自连对照为阴性,可以取两个单克隆提质粒KpnI单酶切,如果有能切出一个1300bp左右的片段,可以认为构建是正确的。
取一个质粒进行测序,测序的时候告知测序公司,此质粒为发卡结构,和poly结构。
附录1.
shRNA启动子
多数的siRNA表达载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种,操纵一段45—50nt的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达,shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA,。采用RNA pol III启动子的原因是由于它有明确的启始和终止序列,总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA,遇到4—5个连续的U即终止,并且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来,非常精确,,会在3’端形成2个突出的尿嘧啶,这类似于天然的siRNA,因而有利于双链RNA诱发RNAi。要使用这类载体,需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火后克隆到相应载体的pol III 启动子下游。克隆的过程需要几天的时间,也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
先在体外构建能表达双链RNA的载体,再将载体转移到细胞内在细胞内合成出双链RNA,不但能增加有效转染细胞的种类,而且在长期稳定表达载体的细胞株中,双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用
。
启动子和shRNA编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时,这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达,抑制范围包括外源基因和内源基因。
附录2
RNAi的作用机制及siRNA的合成方法