实验二溶血空斑meng.ppt

实验二
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血清分离(眼球取血)
脾细胞制备(吹气球法)
溶血空斑试验
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血清分离
眼球采血:左手抓住小鼠颈部皮肤,轻压在实验台上,取侧卧位,左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压,使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球,将鼠倒立,用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。-。
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【操作方法】
,
4 ℃静置24H 10000rpm/10min,收集血清;
-20℃保存待抗体水平检测。同时采集正常小鼠血清作为对照。
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小鼠B细胞溶血空斑形成试验
溶血空斑形成试验是基于抗原抗体反应可活化补体,溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外试验方法,经典的试验是用于检查动物的抗体产生功能。
将绵羊红细胞(SRBC)免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液,与一定量的绵羊红细胞混合,在补体参与下,使抗体产生细胞周围的SRBC溶解,形成一个肉眼可见的溶血空斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。
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【试剂与器材】
1. 健康小鼠(约18~20 克重)。
2. 绵羊红细胞悬液(%)。
3. 指示细胞悬液: 含10% 绵羊红细胞悬液
,补体(即新鲜豚鼠血清),
Hank′s 。
4. Hank′s 液()。
5. 动物解剖器械、注射器(5ml)、平皿、中
试管、小试管、乳头吸管、载物玻片、
6. 盖玻片、双面胶、微量进样器和离心机等。
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【操作方法】
免疫动物
% 绵羊红细胞悬液2ml,无菌操作注射于小鼠腹腔内。(4 天后追加一次免疫效果更佳)。
见试验一,已做
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制备脾细胞悬液
天的小鼠颈椎脱位处死,75%乙醇浸泡3分钟,取出小鼠置于无菌纸上,左腹侧朝上;
,撕开皮肤,暴露腹壁,可见红色长条状脾脏;
,剪开后上翻,暴露脾脏,用镊子提起脾脏,眼科剪分离脾脏下面的结缔组织,取出脾脏。放入盛有5ml Hanks 液的培养皿中;
,右手用5ml 的注射器抽取平皿内液体(4~5ml)缓缓注入脾脏内,将脾细胞冲洗出来。如此反复冲洗,到脾脏变白为止。
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,再用少量Hank′s 液冲洗脾脏及平皿内残留的细胞,移入试管内。离心1000 转/分5~ 10 分, 弃上清,加5ml 冷红细胞裂解液(NH4Cl 双蒸水+Tris ),将细胞离心管插入碎冰中,每2 分钟摇动1 次,裂解10 分。离心(1000转/分)5~10 分。弃上清,用Hank′s 液洗2 次,离心(1000 转/分)5~10分钟。弃上清。用Hanks悬浮细胞,调细胞浓度到2×l06/m1。
。 放小试管中,′s 液,即为500 倍稀释的脾细胞悬液。
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眼球取血→处死小鼠→取脾→用10ml洗液冲脾→离心2000r/min 8min→弃上清,加裂解液2ml,混匀,2min后离心(转数、时间同上)→弃上清加洗液10ml,混匀,离心(同上)

+(A液),混匀

(A液)+ ,混匀

取50ul加入玻片小室(约用30ul)
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