生理实验方案.doc

插条体内生根抑制物质的生物测定
试验材料与设计
2008年8月取当年生光皮树嫩枝插条在85℃恒温下烘干至恒重。烘干后剪碎,,用蒸馏水定容至25ml,浸提24h。24h后过滤,得到插穗的浸提液。将浸提液稀释,使其浓度分别为原浸提液浓度的10%、20%、25%、30%、40%和50%。
本试验所用的白菜籽为市售的白菜籽,发芽率为≧85%,含水量≦7%,净度为≧98%。%高锰酸钾溶液消毒1h后,用蒸馏水冲洗.。
测定方法
用所得的不同浓度的光皮树浸提液浸泡处理后的白菜籽,同时用蒸馏水浸泡白菜籽做对照,每个处理重复3次,每次重复100粒,浸泡5h后,分别将浸泡的白菜籽置于培养皿上,用保鲜膜封口,放于恒温25℃的光照下进行培养。每天记录发芽数,48小时后统计白菜籽的发芽率(以露出子叶作为发芽的标准)[45-46]。
嫩枝扦插生根的生理学基础研究
试验设计
2008年8月30日取半木质化的光皮树枝条进行扦插,插穗全部用200mg·L-1的1号生根剂处理1 h,然后插于全为珍珠岩的基质中,同时用清水处理做对照。在扦插后第0、3、7、17、27、38、45 d时取样,共七次,用于测定各项生理生化指标。
测定方法
本试验主要是针对整个光皮树嫩枝扦插生根过程中,与生根有关的营养物质的含量以及一些重要酶的活性的测定。
营养物质的测定
插穗体内与生根密切相关的营养物质主要是可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、全氮等,其中可溶性糖与全氮的比值(C/N)是衡量插穗生根营养是否合理的重要指标。
可溶性糖、淀粉含量的测定
称取磨碎后干插穗25mg样品倒入5mL刻度离心管内,加入2mL80%酒精,置于80℃水浴中不断搅拌40min,离心,收集上清夜,其残渣加2ml80%酒精重复提取2次,合并上清夜。在上清夜中加5mg活性炭,在80℃脱色30min,定容至5ml,过滤后取滤液测定。吸取提取液1ml,加入5ml蒽***试剂(100mg蒽***溶于100ml稀硫酸中)混合,于沸水浴煮10min,取出冷却后在625nm处测OD值[47]。根据吸光值在可溶性糖标准曲线上查出对应的可溶性糖的含量,再根据下列公式计算样品中可溶性糖的含量。
可溶性糖含量=[查标准曲线所得的糖量(µg)×提取液量(ml)×稀释倍数]/[吸取样品液体积(ml)×样品重(g)×10-6]×100%
将提取可溶性糖以后剩余的干燥残渣,移入50ml容量瓶中,加20ml蒸馏水,放入沸水浴中煮沸15min,·L-1高***酸溶液2ml,提取15min,冷却后用蒸馏水稀释定溶摇匀,用滤纸过滤,,,%蒽***试剂,再沿着管壁缓慢加入5ml浓硫酸,微微摇动,促使乙酸乙脂分解,当管内出现蒽***絮状物时,再剧烈摇动促使蒽***溶解,然后立即放入沸水浴中加热10min,冷却后在620nm波长下比色,记录消光值,在标准曲线上查出对应的淀粉含量[48]。再按下列公式进行计算。
植物样品淀粉含量(mg·g-1FW)=[查表所得的淀粉含量(mg)×样品稀释倍数×10-3]/样品重(g)
可溶性蛋白质含量的测定
称取样品1g放入研钵中,加1ml蒸馏水研磨成匀浆,移到离心管中,然后用3ml蒸馏水分次洗涤研钵,完全转移至离心管后,-,然后在4000r·min-1离心20min,弃去沉淀,上清液转入容量瓶,用蒸馏水定容至10ml,待测。,放入带塞的试管中(每个样品重复2次),加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查得蛋白质含量[49]。再根据下列公式计算样品中可溶性蛋白质的含量。
样品中蛋白质的质量分数/(mg·g-1)=(C×VT)×(1000VS×WF)-1
式中:C-查标准曲线值(mg);
VT-提取液总体积(ml);
WF-样品鲜重(g);
VS-测定时加样量(ml)。
全氮含量的测定
植物样品放在65℃恒温箱中烘干(24h),,,摇匀,加数滴水使样品湿润,然后加5ml浓硫酸,管口上放一弯颈小漏斗,过夜。在烟柜中用调温电炉加热消煮,待无泡沫后,提高温度,但要控制瓶内白烟回流的高度约在瓶颈上部的三分之一处,直到消煮液呈清亮后,再消煮20min左右,冷却后加20ml水,放置澄清后供全氮的测定。往250ml锥形瓶中加入15ml2%硼酸-指示剂溶液,将锥形瓶置于蒸馏装置的承接管下,管口置于硼酸溶液面上3-4cm