基质细胞评分的胃癌临床意义及胃复春胶囊干预机制 陈春.pdf

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E(plexDetection)插件分析核心子网络(Degreecutoff=2,Nodecutoff=,Kcore=2,=100),分析子网络基因生存预后及不同Stage中表达。构建药材-入血成分-靶点关联网络图,根据节点获得每个靶点与其他靶点互相作用,以degree中位数为标准筛选核心入血成分并分析ADMET特性。(geneontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgeneandgenomics,KEGG)富集分析,采用enrichplot、ggplot2包对富集结果进行可视化,从细胞组分、分子功能、生物过程、通路分析胃复春胶囊干预胃癌基质细胞的作用机制。(https:///)数据库下载关键靶点蛋白及晶体构象,通过前处理与核心化合物进行分子对接验证。受体前处理为去原配体、去除溶剂、补充氨基酸残基等。配体前处理为加氢及合适的电荷等。选择晶体结构中配体所在的位置作为结合位点(无原配体的晶体则采用预测位点),选择距离该位点一定半径内的球集为活性结合位点。采用LibDockScore评价小分子化合物与蛋白靶点的结合活力。,以中位数(n=)将其分为低、高基质细胞组,关联临床数据分析结果如图1、OSID科学数据与内容附图1所示。图1显示基质细胞评分与胃癌患者生存时间显著相关,表明基质细胞为潜在的有效干预机制。不同性别、年龄、N、M分期与基质细胞评分无显著差异,不同Stage分期及T分期基质细胞评分存在显著差异(P=-04,P=-07),基质细胞评分在StageⅠ到Ⅱ阶段及TⅠ到Ⅱ阶段中迅速增加,在后续阶段中增长不明显(OSID科学数据与内容附图2),表明早期干预肿瘤微环境:..中的基质细胞增长有一定价值。采用Limma包进行差异分析得1975个DEGs作为潜在干预靶点,具现化为热图及火山图(OSID科学数据与内容附图3(a~b))所示。,疗效确切。基于已公开文献整理得胃复春胶囊入血成分75个[8],其中香茶菜入血成分38个,分析结构以二萜类化合物为主,其次为归属于红参及枳壳的黄***和皂苷,基于TCMSP、SwissTargetPrediction数据库检索、去重、标准化得胃复春胶囊入血成分作用靶点663个。主要入血成分见表1,全表见OSID科学数据与内容附表1。表1胃复春胶囊主要入血成分Table1MainconstituentsofWeifuchunCapsulesdissolvedinblood成分药材归属异橙黄***枳壳香茶菜素U香茶菜诺米林酸枳壳橙桑黄***:..将药物作用靶点与潜在干预靶点取交集,得到107个潜在药物作用靶点(OSID科学数据与内容附图4)导入STRING数据库中分析,共获得107个节点,141条边,,PPI富集P<1×10-16,结果导出至Cytoscape中可视化,并采用MCODE(MolecularComplexDetection)插件分析核心子网络及靶点(Degreecutoff=2,Nodecutoff=,Kcore=2,=100),结果如OSID科学数据与内容附图5所示。分析得核心子网络4个,其中血管细胞粘附因子1(VCAM1)、人纤溶酶原激活物抑制剂1(SERPINE1)、toll样受体4(TLR4),成纤维生长因子(FGF1)为核心子网络的seed靶点,18个靶点为聚集靶点,分别对这18个靶点进行生存分析及不同阶段的表达量分析,结果如OSID科学数据与内容附图6~7所示,SERPINE1、PDGFRB表达与患者生存时间相关极显著(P<),TGFB1、FGF1、MPO表达与胃癌患者生存时间显著相关(P<),VCAM1、NOX4、PDGFRB、ITGAL、TGFB1、R5在Stage分期差异表达极显著(P<),CCR2、PDGFRA、ITGB2、MMP2、SELL差异表达显著(P<)。-入血成分-靶点调控网络(OSID科学数据与内容附图8),节点为靶点或化合物,连线表示成分与靶点之间互作关系。由附图8可知胃复春胶囊通过多成分、多靶点干预胃肿瘤基质细胞组成。异金雀花素B、香茶菜素O、香茶菜素U、蓝萼甲素、橙桑黄***F、5-去***川陈皮素、熊果酸、橙皮素、SudachinoidA、异橙黄***、槲皮素等为潜在核心入血成分(degree>4*median),ADMET预测分析结果如表2所示,核心成分水溶性均介于良好(-4-)。--40-***------40-***--***--:..-----40--------“ClusterProfiler”软件包对交集靶点进行生物功能注释。分别选取GO富集结果/MF前10GOterm绘图(OSID科学数据与内容附图9(a)),交集靶点富集于胞浆钙离子浓度调节、钙离子稳态、细胞钙离子稳态、胞浆钙离子浓度的正调控、细胞二价阳离子稳态、磷脂酶活性的调节等生物过程,以及质膜膜筏、神经元细胞体、膜小凹、轴突末梢等细胞组成以及前列腺素受体活性、G蛋白偶联肽受体活性、肽受体活性、类二十烷酸受体活性、跨膜受体蛋白激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、细胞因子结合等分子功能。KEGG前20富集结果绘图(OSID科学数据与内容附图9(b)),交集靶点通过作用于钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路、人类表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂耐药、Ras信号通路、Rap1信号通路、磷脂酶D信号通路等通路发挥平滑肌收缩调节、晚期糖基化终末产物代谢调节、炎症信号传导调节、细胞存活生长、免疫细胞转移和聚集、机体低氧浓度或缺氧应答等作用。,将子网络核心靶点蛋白作为分子对接受体,采用Libdock对其进行分子对接,对接得分值如表3所示,图2为各核心靶点与入血成分对接结果2D呈现(LibdockScore>70为对接活性良好)。表3核心入血成分与靶点结合得分值(已按照平均得分值排序)Table3Scoresofcoreconstituentsbindingtotargets(sortedbyaveragescore)(1RGB)******(1A7C)***(2Z62)************:..***(1VCA)(1RGB)--targetproteindocking2D3讨论肿瘤细胞行为受肿瘤微环境中基质细胞相互作用影响[9],肿瘤基质中CAF、MSCs等细胞分泌HGF、FGF、ISF-1、IGF-2等因子可促进血管的形成及肿瘤细胞的浸润;周围基质细胞分泌TGF-β诱导内皮细胞向瘤性间质细胞转化从而利于肿瘤细胞浸润;基质细胞可调节组织间隙液压影响药物跨越毛细管以及能直接降低肿瘤细胞对化学药物、酪氨酸激酶抑制剂的敏感性,从而降低了药物疗效。基质细胞随着癌症周期进展含量显著升高,尤以Ⅰ/Ⅱ期变化明显,生存分析显示基质细胞含量低组患者生存时间显著延长,表明基质细胞增长可加快胃癌进展,缩短患者生存时间,因而早期针对基质细胞进行干预有重大意义。此外,低、高基质细胞含量组存在大量基因表达显著失调,而化疗药物由于成分单一、对应靶点少难以覆盖,故中药复方的多成分、多靶点干预策略合理。潜在药物作用靶点的PPI网络分析得到以VCAM1、SERPINE1、TLR4、FGF1为核心的四个子网络,核心靶点及子网络靶点表达与患者生存时间显著相关。VCAM-1为免疫球蛋白超家族成员之一,广泛存在于活化内皮细胞、平缓肌细胞、骨髓基质细胞、巨噬细胞、树突状细胞集成纤维细胞等表面,入血成分干预其表达进而调节炎症反应、细胞和组织的分化及肿瘤的扩散、转移等生物过程[10]。SERPINE1为丝氨酸蛋白酶抑制剂(SERPIN)家族的重要成员,是尿激酶和组织蛋白酶原激活剂(uPA和tPA)的主要抑制剂,在细胞外基:..质重塑中起关键作用,研究显示其可促进血管生成、抗凋亡、诱导肿瘤血管化、激活炎症反应等,与肿瘤进展及转移紧密相关[11-12]。TLR4为toll样受体家族重要成员,通过识别病原相关分子模式而激活相应的信号传导通路,进一步促进NF-κB的激活,TLR4在多种恶性肿瘤组织中呈高表达状态,可促进恶性肿瘤的增殖、抑制肿瘤细胞凋亡及诱导免疫逃逸等[13]。FG