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一种毛发的前处理方法
本发明公开了属于生物化学【技术领域】的一种毛发的前处理方法。该方法首先用清洁剂清洗毛发,晾干,然后将毛发粉碎为片段,最后,将毛发片段加入消化液中,60-100℃水浴5min-2h,使头发水解,水解完成后将上述消化液静置冷却至室温,取上清液进行检测。本发明以毛发为检材,采样容易、可重复取样、非创伤性、保存方便,对常规毛发前处理方法的步骤进行精简、优化,使用的消化液中各种组分,相互间不会产生影响,检测效果良好,检测准确性高,不易有假阳性情况发生,在检测过程中可尽量避免误判情况的发生。
【专利说明】-种毛发的前处理方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学【技术领域】,具体涉及一种适用于检测毛发中滥用药物的毛发前处理方法。
【背景技术】
[0002]目前,日趋严重的毒品问题已成为全球性的灾难。毒品的泛滥直接危害人民的身也健康,并给经济发展和社会进步带来巨大的威胁。据联合国的统计表明,全世界每年毒品交易额达5000亿美元W上,毒品蔓延的范围已扩展到五大洲的200多个国家和地区,而且全世界吸食各种毒品的人数已高达2亿多,其中17?35周岁的青壮年占78%。另一方面,近几年来随着世界各国特别是欧盟、日本、美国等发达国家对食品中药物残留的要求日趋严格,随着仪器设备检测能力和检测技术水准的提高,对动物的药物最高残留限量的要求也越来越严格。
[0003]药物滥用一般是指违背了公认的医疗用途和社会规范而使用任何一种药物。该种使用往往是自行给药,因而对用药者的健康和社会都会造成一定损害。一般常见的药物滥用是指:***品,如阿片类、***类、***类等;精神药品,包括中枢抑制剂,如镇静催眠药,还有中枢兴奋剂,如咖啡因,此外还有致幻剂,如麦司卡林、LSD等;抗生素药品,如青霉素,庆大霉素等;目类兴奋剂药品,如常见的瘦肉精等;W及同化激素和皮质激素等等。
[0004]常用的生物检材如血、尿、胆汁等没有一种可提供像毛发一样长程的用药信息。体液(主要指尿液和血液)仍是药物滥用检验较好的生物检材,但体液中药物的检出时限短、检材不易保存,只能提供个体短期使用药物的信息;而毛发取材容易、无创,携带方便,易长期保存,且药物在毛发中代谢较慢可长期存在,因此毛发分析在鉴定滥用药物方面要比体液分析更实用、方便。十年来,毛发分析技术飞速发展,由于毛发检材本身所具有的独特的优势,人W及动物毛发中滥用药物的检测已开始受到越来越多的关注。很多国家的法化学实验室,毛发分析已成为药物滥用检测的常规操作,并已得到了法庭的承认、采纳。
[0005]毛发的前处理一般分为两步:清洗毛发;毛发的消化、提取。
[0006]毛发的清洗;毛发与外界环境接触,易受污染。就外部污染而言,毛发可分为3个区域;易接触区、半接触区和不可接触区。易接触区是指毛发的表面最外层,容易沾上环境中的污物,甚至药物的粉末,该区采用一些无水有机溶剂洗净;半接触区是指污染物不易进入、而需W水溶液形式能进入的区域,该区需用水或亲水的有机溶剂等洗涂;非接触区是最大的区域,通常占毛发结构的90%左右,是药物与毛发结合的主要区域,洗涂溶剂不能进入该区。毛发的消化、提取:药物固化于毛发的变性角蛋白中,须先消化使其呈游离态再提取。毛发剪碎或磨碎后可增大其表面积,有利于药物的释放。常用的消化方法有碱水解、酸水解、酶水解、甲醇超声等。但是现有的提取方法,如酸、碱水解法,往往水解条件比较激烈,不适合单己醜吗啡等不稳定化合物的样品处理;酶水解法适用范围广,释放效率高,缺点是成本过于昂贵;甲醇超声法适用范围较广,但药物释放不完全且杂质较多。因此,由于缺少一种适用范围广、快速、简便、高效而又不对化合物产生影响的毛发前处理方法,毛发分析工作仍然停留在实验室水平,多年未见到实际产品。
[0007]因此发明一种简单快速高效的毛发前处理方法,W及相应的检测手段是具有非常重要的现实意义的。
【发明内容】
[0008]本发明针对目前的毛发前处理方法适用范围窄,复杂,低效的问题,提出一种毛发的前处理方法。
[0009]-种毛发的前处理方法,按照如下步骤进行:
[0010](1)毛发清洗;用清洁剂清洗,瞭干;
[0011](2)毛发粉碎;将毛发粉碎为片段;
[0012](3)毛发消化;将步骤(2)毛发片段,加入消化液中,60-100°C水浴5min-2h,使头发水解,水解完成后将上述消化液静置冷却至室温,取上清液进行检测。
[0013]所述消化液的组分为;-5%体积份数的?85缓冲液,-10臟〇1/1己酸巧,l-20mmol/L二硫苏糖醇,-2mmol/L十二焼基硫酸轴和1-lOmg/ml蛋白酶K,余量为去离子水。
[0014]。
[0015]所述毛发粉碎的方法为用剪刀剪碎或球磨机磨碎。
[0016]所述清洁剂为水、甲醇、十二焼基硫酸轴中的一种及W上。
[0017]本发明的有益效果;本发明W毛发为检材,不但采样容易、可重复取样、非创伤性、保存方便,最重要的是毛发可W不断生长,可W长期连续动态的对滥用药物进行监控。本发明对常规毛发前处理方法的步骤进行精简、优化,由于使用的消化液水解头发不会带入影响检测的杂质或副产物,因此毛发样品经消化后可直接用于检测,无需进一步溶剂吹干或者萃取等步骤,不仅使得前处理过程简化,节省了时间,而且减少了提取过程中药物的损耗,W及避免使用提取所需的氮吹和萃取装置,因此明显降低了成本。头发当中90%W上为角蛋白,而角蛋白分子间通过脫氨酸的二硫键、氨键、盐键和其它交联键作用形成高度交联的H维结构。因此打开二硫键是提高消化效率的关键。本发明应用还原剂将二硫键打开,破坏角蛋白间牢固的共价结构,然后通过蛋白酶的作用,进一步降解角蛋白,使固化于角蛋白中的药物分子游离出来。本发明使用的消化液中各种组分,相互间不会产生影响,因此直接采用一步法,将消化液加入到头发中进行水解反应,整个操作过程简便、快捷、省时省事。所选用的试剂通过温和的水解毛发,且相应试剂使用的浓度不会对免疫分析等方法检测产生影响,检测效果良好,检测准确性高,不易有假阳性情况发生,在检测过程中可尽量避免误判情况的发生。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为猪毛前处理效果对比图(A为溶解前,B为溶解后)。
[0019]图2为人头发前处理效果对比图(A为溶解前,B为溶解后)。
[0020]图3为猪毛样品中克伦特罗的检测结果。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明做进一步说明。
[0022]实施例1猪毛样品的前处理方法
[0023]%的十二焼基硫酸轴和水进行清洗,在室温下瞭干,然后剪碎成2mm的片段。称取lOmg猪毛至EP管中,加入消化液500ul(%体积分数的PBS缓冲液,Immol/L己酸巧,5mmol/L十二焼基硫酸轴,lOmmol/L二硫苏糖醇,5mg/ml蛋白酶K,余量为去离子水),65°C水浴,每10分钟縱润振荡(也可在超声中进行水浴,加快溶解时间)一次,45分钟后猪毛全部溶解(超声中30分钟),猪毛溶解情况如图1所示。
[0024]实施例2人头发样品的前处理方法
[0025]将收集到人的头发分别用甲醇清洗,用吸水纸吸干,然后剪碎成2mm的片段。称取2mg头发至EP管中,加入消化液150ul(%体积分数的PBS缓冲液,Immol/L己酸巧,5mmol/L十二焼基硫酸轴,lOmmol/L二硫苏糖醇,15mg/ml蛋白酶K,余量为去离子水),65C水浴,每10分钟縱润振荡(有条件可在超声中进行水浴,加快溶解时间)一次,35分钟后头发全部溶解(超声中25分钟),头发溶解情况如图2所示。
[0026]实施例3检测猪毛样品中克伦特罗的前处理方法
[0027]在屠宰场现场尿检筛查中发现3头猪克伦特罗阳性,并随即选出10头阴性的猪,收集该13头猪的猪毛,%的十二焼基硫酸轴和水进行清洗,在室温下瞭干,然后剪碎成2mm的片段。称取lOmg猪毛至EP管中,加入消化液500ul(%体积分数的PBS缓冲液,Immol/L己酸巧,5mmol/L十二焼基硫酸轴,5mmol/L二硫苏糖醇,5mg/ml蛋白酶K,余量为去离子水),65°C水浴20分钟,每5分钟縱润振荡,然后置于沸水中水浴5分钟,结束后静置冷却至室温,取lOOul上清液进行检测。克伦特罗检测试剂盒购于杭州迪恩科技有限公司,商品名为克伦特罗一步法化ISA试剂盒,按试剂盒说明书进行操作检测,检测结果如图3所示。
[0028]实施例4检测人头发样品中吗啡的前处理方法
[0029]阳性毛发样品由某戒毒所提供,阴性样品从普通人处获得,并通过尿检复核吗啡阳性和阴性情况。将收集到人的头发分别用甲醇清洗,用吸水纸吸干,然后剪碎成2mm的片段。称取2mg头发至EP管中,加入消化液150ul(%体积分数的PBS缓冲液,Immol/L己酸巧,2mmol/L十二焼基硫酸轴,5mmol/L二硫苏糖醇,lOmg/ml蛋白酶K,余量为去离子水),65C水浴20分钟,每5分钟縱润振荡,然后置于沸水中水浴5分钟,结束后静置冷却至室温,取lOOul上清液进行检测。吗啡检测卡购于BiosynexDeutschlandGmbH,商品名化ugsofAbuseRapid化stDevice,按检测卡说明书进行操作检测,检测结果如表1所示。
[0030]表1
[0031]
【权利要求】
,其特征在于,按照如下步骤进行:(1)毛发清洗:用清洁剂清洗,晾干;(2)毛发粉碎:将毛发粉碎为片段;(3)毛发消化:将步骤(2)毛发片段,加入消化液中,60-KKTC水浴5min-2h,使头发水解,水解完成后将上述消化液静置冷却至室温,取上清液进行检测。
,其特征在于,所述消化液的组分为:-5%体积份数的?85缓冲液,-10臟〇1/1乙酸钙,1-20111111〇1/1二硫苏糖醇,-2mmol/L十二烷基硫酸钠和l-10mg/ml蛋白酶K,余量为去离子水。
,其特征在于,。
,其特征在于,所述毛发粉碎的方法为用剪刀剪碎或球磨机磨碎。
,其特征在于,所述清洁剂为水、甲醇、十_焼基硫酸納中的一种及以上。