2-酶学基础课件.ppt

该【2-酶学基础课件 】是由【luyinyzha】上传分享，beplayapp体育下载一共【106】页，该beplayapp体育下载可以免费在线阅读，需要了解更多关于【2-酶学基础课件 】的内容，可以使用beplayapp体育下载的站内搜索功能，选择自己适合的beplayapp体育下载，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此beplayapp体育下载到您的设备，方便您编辑和打印。第二章分子克隆的工具酶
工具酶:进行DNA操作经常要用到的“工具”——酶
工具酶(四大类)
核酸酶nucleases
脱氧核糖核酸酶deoxyribonuclease
核糖核酸酶ribonuclease
外切酶exonuclease
单链外切酶
双链外切酶
内切酶endomuclease
限制性内切酶
非限制性内切酶
连接酶ligase
聚合酶polymerase
修饰酶modificationenzyme
有人也简单的将它分为两类:限制酶和其他酶类(连接酶,聚合酶,核酸酶,激酶,磷酸酶)。
上述酶的分类不是绝对的,因有的酶兼有数种功能,如:聚合酶有外切酶功能;内切酶有***化酶功能等。
四大酶类大都是从细菌和phage中纯化出来的,它们原本参与细菌/phage自身DNA的复制、转录、降解外源入侵DNA分子、修复突变、重组等一系列生命活动,被纯化后用来在人工条件下进行体内类似的反应。
噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力,取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。例如,将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株,其生长效率往往会削弱,对这两个菌株的滴定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株,但是若先将它们感染原来的宿主菌,再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时,感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用(host—controlledrestriction)。
用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明,在受感染的宿主细胞中,噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解;然而,用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNA的降解。如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒(或其他来源)DNA的核酸酶,那么,它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来,之所以能够如此,乃是通过称为宿主控制的修饰作用(host-controlledmodification)。
限制(restriction)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNA的分解作用,一般是指对外源DNA侵入的限制。
修饰(modification)作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用(如***化),经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。
到20世纪60年代中期,科学家推测细菌中有限制-修饰系统(restriction—modificationsystem,R-Msystem)。该系统中有作用于同一DNA的两种酶,即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶,而且,这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来,不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制-修饰系统。

按照国际命名法,限制性核酸内切酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多,而且越来越多,并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆,1973年Smith和Nathans对内切酶的命名提出建议;1980年,Roberts对限制性酶的命名进行分类和系统化。
限制酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的一个首字母,再加上序号,
A、第一个字母大写,表示该酶来源的细菌属名的第一个字母
B、第二、三个字母小写,表示该酶来源的细菌的种名的前2个字母
C、第四个字母大写代表不同的变种/品系
小写代表不同的菌株和型
D、最后罗马字母,代表同一菌株中不同的限制性内切酶
属名种名株名
HindIIIHindIII
Haemophilusinfluenzaed
嗜血流感杆菌d株
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
注意限制性内切酶的正确写法:
1、前3个字母一定斜体
2、字母与罗马数字间空格
如:EcoRIPstI
I类限制性核酸内切酶
I类限制性核酸内切酶的分子量较大,一般在30万道尔顿以上,通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R(135kD),M(62kD)和S(55kD)三种亚基组成的复合酶,这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为449kD,共5个亚基,其中R亚基和M亚基各两分子。Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶,同时在酶分子上还具有***化酶和ATPase的活性,所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要Mg2+作辅助因子外,还要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列,大约15个碱基对。
Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别DNA分子,并能同DNA分子作用,因其识别DNA后,要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右),并且要形成一个环才能切割DNA(图),所以识别位点和切割位点不一致,产生的片段较大。