2章DNA重组课件.ppt

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(略)


线粒体和叶绿体DNA
质粒DNA
病毒和噬菌体DNA
染色体DNA
天然DNA
1、准备生物材料
选择生物种类;选择DNA易提取和含量高的组织;选择DNA得率最高的生长期。如:
大肠杆菌质粒DNA:应在对数生长期后期。
植物DNA:选幼嫩植株或黄化幼苗。
肝脏DNA:要清除胆囊。
2、裂解细胞
这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的关键步骤。
原核细胞:用溶菌酶,NaOH和SDS,煮沸,冰冻,超声波等方法;
结构复杂的动、植物材料:先必须粉碎(液氮冻结后研磨,或捣碎机、研钵直接粉碎),再参照裂解原核的方法。
3、分离和抽提DNA
提取总DNA:在裂解液中加适量酚/***仿/异戊醇或***仿/异戊醇等有机溶液,使DNA与蛋白质分开,用乙醇或异丙醇沉淀DNA,再离心。
提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA:须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体,抽提前必须经DNase处理,水解附着于其表面的其它DNA。
提取质粒DNA:,所有DNA都变性沉淀,再调节PH至中性,质粒DNA复性后从沉淀物中释出。
除RNA:用RNase水解除RNA,
分离抽提DNA最有效的方法:***化铯梯度离心(***化铯溶液中加适量溴化乙锭,紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光,但沉降系数明显不同而聚集于不同的***化铯密度区)

碱裂解法*:
原理:细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂中,会使细胞壁破裂,染色体DNA和蛋白质变性,相互缠绕成大型复合物,被SDS包盖,当用钾离子取代钠离子时,复合物会从溶液中有效地沉淀下来,离心去除后,就可从上清中回收质粒DNA。
加150μl溶液Ⅲ,盖紧管口,将管倒置,温和振荡20s,使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解液中分散均匀,之后将管置于冰上5min。
4℃离心12000g,5min,上清转移至另一离心管中。
加等体积酚-***仿-异戊醇(25:24:1),振荡混匀。
4℃离心12000g,5min,上清转移至另一离心管中。
用2倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒DNA,振荡混匀,于室温放置2min。
4℃离心12000g,5min。小心吸去上清夜,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。
用1ml70%乙醇溶液洗涤沉淀,4℃离心12000,5min,弃去上清,在空气中使核酸沉淀干燥。
用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μlg/ml)的TE重新溶解核酸,振荡,贮存于-20℃。
试剂:(1)溶液Ⅰ:50mmol/l葡萄糖
25mmol/lTris-HCl()
10mmol/lEDTA-Na2()
5mg/ml溶菌酶(临用时加)
(2)溶液Ⅱ(新鲜配制):
200mmol/lNaOH
1%(W/V)SDS
(3)溶液Ⅲ(100ml):
5mol/lKAc60ml
()


溶源周期
溶菌周期
提取λDNA的原理:
先将溶源菌培养至一定密度,通过热诱导,使λDNA从宿主染色体DNA上释放出来,再经过溶菌周期培养,获得大量λ噬菌体,从中提取线形的λDNA。
提取过程:
溶源菌诱导培养
分离λ噬菌体
λDNA的提取

***化铯-溴化乙锭连续梯度离心法

用三烃******化铵层析树脂纯化DNA
用羟基磷灰石纯化DNA

“基因纯”试剂纯化

正丁醇(或异戊醇)抽提法
Dowex树脂层析法