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转化寇氏隐甲藻的方法
本发明涉及转化寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)的方法,该方法包括以下步骤:预培养寇氏隐甲藻;预培养农杆菌;在渗透压调节剂的存在下悬浮寇氏隐甲藻及农杆菌,然后将完整的寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养;和获得农杆菌转化的寇氏隐甲藻。
【专利说明】转化寇氏隐甲藻的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域。具体涉及用农杆菌转化寇氏隐甲藻的方法。
【背景技术】
[0002]寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)按照NCBITaxonomy数据库分类,属于Eukaryota界Alveolata(囊泡虫类)Dinophyceae(甲藻门)GonyaμIacales目Crypthecodiniaceae科Crypthecodinium属。该藻是一种比较原始的真核生物,具有核膜不连续、染色体始终高度凝集、细胞壁厚等特性[刘晓玲等,寇氏隐甲藻染色体的提取及其独特的超微结构,实验生物学报,2000,33(2):189-1]。
[0003]寇氏隐甲藻有较好的二十二碳六烯酸(DHA)合成能力。DHA占细胞脂质的30%以上[Wynn等·Productionofsinglecelloilsbydinoflagellates,inSingleCell0il(ZViCohen&ColinRatledge)
,A0CSPress,Urbana],尤其是产物脂质组分少。,DHA占总脂肪酸组成的59%,且脂肪酸组成简单[Colin等·ProductionofdocosahexaenoicacidbyCrypthecodiniumcohniigrowninapH-,Lipid,36(11):1241-1246]。隐甲藻的脂肪酸一般含有DHA及棕榈酸、油酸、硬脂酸等,少见鱼油或裂壶藻油中的EPA、DPA等不适合婴幼儿服用或不确定功能的组分,因此一度成为唯一适用婴幼儿配方食品的DHA藻油。
[0004]目前对寇氏隐甲藻生产性能的优化主要集中在发酵改良上,典型如Colin等人的US7674609、Martek公司的US7678931,以及商业化生产产品DHASC0。DeSwaaf的文献报道实现了l〇9g/L生物量19g/LDHA产量的流加发酵[-cell-densityfed-batchcultivationofthedocosahexaenoic-,2003,61(1):40-43]。对隐甲藻的培养,一般使用较高盐浓度,常见25g/L的海盐,也有见使用25g/LNaCl的[-,-006-0081-8]
,。其他因素如温度、pH、碳源、氮源对寇氏隐甲藻合成DHA的影响也有报道[,2002,21(4):344-346]。个别专利提及了对隐甲藻进行改造,如通过离子束进行诱变()。
[0005]隐甲藻分子生物学方向的研究还较少,(siliconcarbide)对隐甲藻完整细胞进行转化后(效率每IO7个细胞得到5-24个转化子)[(AmphidiniumandSymbiodinium):,13(3):427-435]后,未见对寇氏隐甲藻进行遗传转化的公开报道;也未见对隐甲藻DHA合成的机理进行探索的尝试,无法解释其具有优良脂肪酸组成的原因。目前仅在BASF公司专利《MethodFortheProductionofMyltiple-UnsaturatedFattyAcidsinTransgenicOrganisms》提到两个寇氏隐甲藻Δ-5延长酶基因序列(如US20080155705中SEQ47/49),但仅表示该基因可用于构建产油的转基因生物中,未涉及隐
甲藻的基因工程研究。目前对隐甲藻的分子生物学改造、研究公开文献资料很少。
[0006]寇氏隐甲藻的DHA产量较高,油脂组分非常简单,是很好的DHA生产菌株。但目前尚无对隐甲藻进行基因工程改造的报道。
【发明内容】
[0007]发明人出乎意料地发现,在农杆菌与寇氏隐甲藻悬浮时,如果加入调节渗透压的物质,可以实现农杆菌对寇氏隐甲藻完整细胞的成功转化,达到比现有技术高的转化效率。
[0008]具体地,本发明涉及转化寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)的方法,该方法包括以下步骤:在渗透压调节剂的存在下悬浮寇氏隐甲藻及农杆菌,然后将完整的寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养;和获得农杆菌转化的寇氏隐甲藻。所述渗透压调节剂是添加在IMN中,所述IMN使用农杆菌转化常用的诱导培养基(Inductionmedium,简称IM),通过选自钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、有机物的渗透压调节剂调节頂的渗透压来配制。具体地,所述渗透压调节剂可以是钠盐。具体地,所述渗透压调节剂可以是***化钠、硫酸钠、***化钾、***化钙、葡萄糖或山梨醇。上述渗透压调节剂的浓度可以是100mM-700mM,优选是100mM-650mM,更优选是200mM-400mM。在本发明的方法中,可以预培养寇氏隐甲藻到对数初期将寇氏隐甲
藻细胞与农杆菌共培养。在本发明的方法中,可以将寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养。具体地,在本发明中使用的寇氏隐甲藻可以是ATCC30772和ATCC40750。
[0009]在寇氏隐甲藻的预培养过程中,可以使用常规的CA培养基。其成分可以是葡萄糖9-3(^/1,-,50-75%海水(或人造海盐配制),?-。其中还可以额外添加硫酸钠或***化钠,以调节其渗透压。
[0010]在寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养中,使用常规的頂培养基效果不佳。发明人出乎意料地发现,在IM中添加上文所述的调节渗透压的物质,可以实现良好的转化效果。
[0011]农杆菌是一种本领域技术人员常用的转化工具。如本领域工作者所熟知的,决定农杆菌毒性的基因在野生型农杆菌中以质粒形式存在,根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中称为Ti质粒,发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)中称为Ri质粒。这两种质粒均含有毒力基因Vir(Virulence)区和转移DNA(transferDNA,T-DNA)区。Vir区的基因表达出来后,将T-DNA边界序列之间的区域转移并整合到宿主基因组中。Vir区包含许多基因,有些基因的表达需要酚类化合物的诱导,通常植物的受伤部位或天然地分泌这类化合物,实验室条件下常用如乙酰丁香***来人为促使Vir基因的表达。诱导培养基(IM)中适当的pH、糖类浓度、磷酸浓度,以及诱导时的温
度条件会促进Vir基因受酚类物质诱导表达的效果[,2011,31(7):126-132],从而提高农杆菌的转化效率。通常农杆菌转化,需要宿主细胞适当地暴露或创伤,如使植物组织形成创伤、真核生物先制备成原生质体等。本发明使用经渗透压调节剂调整后的頂来悬浮预培养的细胞,可以使农杆菌高效地转化完整的寇氏隐甲藻,无需麻烦的原生质体制备过程。本发明的关键在于预培养细胞悬浮液中渗透压调节剂的加入,而所举例的頂配方可经本领域技术人员适当的修改。同样的,本发明頂N的盐及糖或醇的浓度条件,主要作用对象为寇氏隐甲藻,因此本发明的应用不限于本发明实施例所列农杆菌,常见的根瘤农杆菌和发根农杆菌工具菌株,包括但不限于EHA105、LBA4404、AGLO等都可以用于本发明。本发明实施例使用双元载体系统模式,通过K7载体构建重组农杆菌,但本发明的重点不是重组农杆菌的构建方式,因此本发明的应用包括但不限于双元载体系统、一元载体系统。外源基因转入农杆菌中的方式以及外源基因转入农杆菌借助的载体并不是本发明的关键,本领域技术人员可以根据常识进行选择。本发明实施例为了鉴定阳性转化子,特别在农杆菌中用k7载体导入了zeocin抗性基因和⑶S基因作为标记基因,这些基因并不是转化方法所必须的,因为它们并不决定转化的效率,只是筛选阳性转化子所需要的。本
领域研究者可以简单地通过成熟的技术导入其它元件,包括但不限于药物抗性基因、酶基因、基因表达调控元件、基因敲除元件、基因定点突变元件等;包括含T-DNA边界序列的载体为出发载体,不限于pCAMBIA系列载体。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:构建重组农杆菌用K7质粒示意图。载体上含在重组寇氏隐甲藻内起作用的筛选标记zeocin抗性基因,含有在重组农杆菌内起作用的筛选标记卡那霉素抗性基因,含有CaMV35S启动子以及EcoRI-HindIII等限制性内切酶位点组成的多克隆位点区(MCS)、含有左边界T-DNA重复及右边界T-DNA重复两个T-DNA边界区域。农杆菌将左边界T-DNA重复、CaMV35SPolyA、zeocin、CaMV35S启动子、MCS、CaMV35S启动子、⑶S、NosPolyA、右边界T-DNA重复这一段转到寇氏隐甲藻中,并整合到基因组上。
[0013]图2:CA_1体系转化寇氏隐甲藻所获的抗zeocin菌落PCR检验的结果。1泳道样品为重组农杆菌菌落为模板的PCR阳性对照,2泳道为构建重组农杆菌所用K7质粒为模板的PCR阳性对照,4-11泳道为随机挑选的抗zeocin重组寇氏隐甲藻菌落为模板的PCR扩增产品。虚线框表明重组寇氏隐甲藻菌落得到了与阳性对照一致的PCR检测条带。
[0014]图3:CA-2体系所获抗性菌落PCR检验结果。1、2泳道为重组农杆菌、K7质粒为模板进行的PCR阳性对照。3-6泳道为四个随机挑选的zeocin抗性寇氏隐甲藻菌落PCR检测结果。虚线框表明重组隐甲藻菌落获得了与阳性对照一致的PCR检测条带,M为Takara公司DL5000核酸标记物。
[0015]图4:优化实验所得抗性菌落PCR检测的结果。M泳道为Takara公司IkbDNAladder,1-12为随机挑选的zeocin抗性寇氏隐甲藻菌落。8、9、11泳道为未得到特异性的PCR产物,为PCR检测的阴性样。
[0016]图5:寇氏隐甲藻培养终点阶段对农杆菌介导的转化效率的影响。结果显示,培养寇氏隐甲藻到对数初期比对数末期有更好的转化效果。
[0017]图6:MN溶液中***化钠浓度对转化效率的影响。51mM为正常頂诱导液中Na离子的浓度,200-700mM为任选的几种Na离子浓度条件。
[0018]图7A:相同浓度下(350mM),使用有机溶剂糖类(葡萄糖为代表)、醇类(山梨醇为代表)配置的頂N溶液处理寇氏隐甲藻后,农杆菌转化的效率与***化钠的对比。
[0019]图7B:350mM阳离子浓度、不同无机盐配制的MN溶液处理寇氏隐甲藻后,农杆菌转化转化效率图。
[0020]图8:寇氏隐甲藻ATCC40750与寇氏隐甲藻ATCC30772在本发明条件下转化效率的对比。
【具体实施方式】
[0021]如无具体说明,本发明的各种原料均可以通过市售得到;或根据本领域的常规方法制备得到。除非另有定义或说明,本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
[0022]本发明的其他方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
[0023]下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准,则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明,否则所有的份数为重量份,所有的百分比为重量百分比。
[0024]除非另有定义或说明,本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
[0025]如本文所用,"含有"、"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构成"、"基本上由......构成"、和"由......构成";"主要由......构成"、"基本上由......构成"和"由......构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0026]可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0027]可使用本发明方法转化的寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)包括但不限于:ATCC40750,TEXL1649,ATCC30556,ATCC50051,UTEXL1649,RJH,ATCC30772,CCMP316,ATCC50297,ATCC30556等。
[0028]可用于本发明方法的农杆菌可以是本领域已知的各种用于基因转化的农杆菌,包括但不限于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105、EHA101、LBA4404、AGL-0、AGL-1、NT1、C58-Z707、GV3101::pMP90等。
[0029]本发明方法中,使用农杆菌转化完整的寇氏隐甲藻细胞。"完整的寇氏隐甲藻细胞"指细胞结构完整,包括细胞壁、细胞膜等寇氏隐甲藻细胞应有的结构。更具体而言,完整的寇氏隐甲藻细胞不是寇氏隐甲藻原生质体,后者经处理而不含有细胞壁。
[0030]本发明中,农杆菌含有感兴趣的目标基因。所述目标基因可以是任意脱氧核糖核酸。所述目标基因相对于待转化的寇氏隐甲藻而言可以是外源的,即该寇氏隐甲藻自身不