一株红球菌以及用于制备光学纯(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途.docx

该【一株红球菌以及用于制备光学纯(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途 】是由【开心果】上传分享，beplayapp体育下载一共【10】页，该beplayapp体育下载可以免费在线阅读，需要了解更多关于【一株红球菌以及用于制备光学纯(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途 】的内容，可以使用beplayapp体育下载的站内搜索功能，选择自己适合的beplayapp体育下载，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此beplayapp体育下载到您的设备，方便您编辑和打印。一株红球菌以及用于制备光学纯(r)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途一株红球菌以及用于制备光学纯(r)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途本发明涉及一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途,该红球菌(us?baikonurensis),实验室编号为ECU1014,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,?,利用该菌株的静息细胞作为生物催化剂制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途。本发明所述的菌株用于不对称还原制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的生物工艺具有产物浓度高,反应条件温和,原子经济性强,不需要额外添加昂贵的辅酶,操作简便,易于放大等特点,在(R)-硫辛酸中间体的生产中具有很好的工业应用前景。【专利说明】—株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途【技术领域】[0001]本发明属于生物工程【技术领域】,涉及一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途,该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号),。【背景技术】[0002]a-硫辛酸是一种能消除老化与致病的自由基的类似维他命的化合物,可协助辅酶进行有利于机体免疫力的生理代谢,是一种万能抗氧化剂药物。文献报道a-硫辛酸对肝脏疾病、糖尿病、艾滋病、肿瘤等许多疾病的治疗都有一定的效果。(R)-a-硫辛酸是人体内硫辛酸的天然形式,(S)-a-硫辛酸基本没有生物活性但也无副作用。如能得到光学纯的(R)-a-硫辛酸,患者服用药物剂量可减少一半,显然更有价值的(R)-C1-硫辛酸替代外消旋的硫辛酸是必然趋势。(R)-6-羟基-8-***辛酸乙酯是(R)-a-硫辛酸合成的重要手性中间体,其合成方法有两类:化学合成和生物合成法。与化学合成法相比,生物合成的方法具有反应条件温和、催化效率高、选择性高等多种优点。生物合成法又包括两种方法,一是通过脂肪酶催化外消旋的酯或者羟基酸进行动力学拆分,二是通过还原酶对潜手性***进行不对称还原。后者由于其理论产率可达100%,远高于前者的50%理论产率,更受研究者的青睐。[0003]目前仅有3篇文献报道用不对称还原制备(R)-6_羟基-8-***辛酸酯的方法。在这3篇文献中,底物浓度最高的达到200mM(45g/L),但它需要添加高达4mM的昂贵辅酶,反应时间长达24h,转化率只有95%,产物的ee值没有提及(W02007028729);Muller等应用来自于Thermoanaerobacterbrocki的醇脱氢酶不对称还原6_羰基_8_***辛酸甲酯得到相应的(R)-6-羟基-8-***辛酸甲酯,%,是目前文献报道的最高水平,,(DTT),并且转化率仅有85%(US7157253B2)。Olbrich等利用Geotrichumcandidum野生菌细胞还原5g/L的6-羰基-8-***辛酸甲酯制备(R)-6-羟基-8-***辛酸甲酯,得率仅为62%,产物的ee值仅为88%(US7135328B2)。[0004]以上方法普遍存在转化率低、反应时间长、需要添加昂贵辅酶、成本高等严重缺陷,与工业化生产的要求相距甚远。【发明内容】[0005]本发明所要解决的技术问题是,已报道的酶促不对称还原制备(R)-6-羟基-8-***辛酸酯的方法中普遍出现的转化率低,反应时间长,需要添加昂贵辅酶及其它添加剂等问题。[0006]本发明提供一株红球菌以及用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇的用途[0007]本发明通过下述具体技术方案以解决上述技术问题:[0008]本发明的发明人从土壤中,经过初筛、复筛及分离纯化,获得一株能高效率不对称还原制备(R)_6_羟基-8-***辛酸酯的红球菌(usbaikonurensis),实验室编号为E⑶1014,该菌株在2013年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(),地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号,。[0009]usbaikonurensisECU1014()具有如下特征:[0010][0011]球状,2-3iim,革兰氏染色阳性;[0012][0013]可在温度25-35°C,pH5-9环境中生存;[0014][0015]淡粉色,潮湿状,底部有隆起,边缘粗糙,不透明。[0016]经I6SrDNA鉴定,确认该菌株为(usbaikonurensis),usbaikonurensisECU1014。[0017]usbaikonurensisEQJ1014可以不对称合成光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酯及其它光学活性手性醇,包括下列步骤:[0018][0019]usbaikonurensisEQJ1014米用本领域常规的方法,在发酵培养基中进行扩增培养24-36h,温度20-50°C;[0020]再以上述培养液做为种子,基于发酵培养基体积的接种量为I-10%(v/v),接种至50mL的发酵培养基中,在20-50°C下100-160rpm摇床上培养24-48h,离心得到静息细胞;[0021]所述的发酵培养基可采用常规的培养基,其中各组分的含量如下:葡萄糖10-50g,蛋白胨I-20g,KH2PO4I-10g,K2HPO4I-10g,-2g,-2g,水IOOOmL,pH3-8。[0022][0023]将收获的静息细胞,-,静息细胞的含量为I-300g(湿重)/L;在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下,对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应,制得光学活性手性醇。[0024]所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为I-15mmol/L(6-羰基-8-***辛酸乙酯为I-300mmol/L)。-3kU/L(以6-羰基-8-***-60kU/L)。-(以6-羰基-8-***-90g/L)。外加NAD+的用量较佳的为0-,如磷酸-磷酸钠缓冲液。-,所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的为20-35°C。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准。不对称还原反应结束后,可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。[0025]在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。[0026]本发明的积极进步效果在于:本发明针对已报道的生物催化不对称合成(R)-6-羟基-8-***辛酸酯的研究中存在产物浓度不高,转化率低,反应时间长,需要额外添加昂贵辅酶等问题,筛选得到一株红球菌作为催化剂,不对称还原6-羰基-8-***辛酸酯及其它潜手性***。在催化浓度高达300mmol/L(66g/L)的底物时,转化率仍可达99%以上,反应时间为36h,产物的ee值为93%,且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于已报道的其它不对称还原制备(R)-6-羟基-8-***辛酸酯的方法,具有一定的工业应用前景。【具体实施方式】[0027]以下通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。其目的仅在于更好地理解本发明的内容,而非限制本发明的保护范围。[0028]实施例1菌株的筛选[0029]配制富集培养基,成分如下:(NH4),,,,;另配制丰富培养基,组成如下:葡萄糖15g/L,酵母膏5g/L,蛋白胨5g/L,KH2PO4LOg/L,K2HPO4LOg/L,,。在250mL的三角烧瓶内装50mL的富集培养基和2mM的底物作为碳源,加入土样后,于30°C,180rpm培养I-6天。之后将该培养液涂布于丰富培养基平板上,30°C培养I-3天,长出的单菌落进行平板划线分离纯化。底物为6-羰基-8-***辛酸乙酯。[0030]将得到的单菌落接种到液体丰富培养基中,在30°C,180rpm培养2天后,取一定量的湿细胞(-)悬浮于ImL磷酸缓冲液(PBS,50mM,)中,添加底物6-羰基-8-***辛酸乙酯(10mM,以乙醇助溶)和5%葡萄糖,在30°C,1100rpm条件下反应24h。反应结束后,使用薄板层析(TLC)分析产物/底物比例,选择产物比例高的菌株进行复筛。[0031]复筛中,菌体的培养方法和条件同上,反应结束后离心(12,000rpm,5min),收集的上清液用乙酸乙酯萃取两次,取上层有机相,用无水NaSO4干燥过夜,进行气相色谱分析,测定底物转化率和还原产物的ee值。[0032]筛选结果是编号为ECU1014的菌株催化还原时具有最高的转化率与ee值。[0033]产物ee值的具体分析条件如下:[0034]使用气相色谱仪进行分析,色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasi1-DEXCB,以氮气为载气,进样口温度280°C,检测器温度280°C,反应产物乙酰化后进行分析,柱温160°C。[0035]实施例2-8静息细胞催化羰基化合物的不对称还原[0036]在ImL憐酸钠缓冲液(100mmol/L,)⑶1014的静息细胞和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见JournalofIndustrialMicrobiologyandBiotechnology2011,38,633-641),分别加入终浓度为lOmmol/L的潜手性羰基化合物(实施例2-8),+和3g/L的葡萄糖。在30°C,IlOOrpm振荡反应24h。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取,萃取两次,合并萃取液,加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值,结果见表I。[0037]产物ee值的具体分析条件如下:[0038]使用气相色谱仪进行分析,色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEXCB,以氮气为载气,进样口温度280°C,检测器温度280°C,其它条件如下:[0039]实施例2:反应产物乙酰化后进行分析,柱温80°C;[0040]实施例3:柱温160°C;[0041]实施例4:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160°C;[0042]实施例5:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160°C;[0043]实施例6:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160°C;[0044]实施例7:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160°C;[0045]实施例8:反应产物乙酰化后进行分析,柱温160°C;[0046]【权利要求】(usbaikonurensis),。()用于制备光学纯(R)-6-羟基-8-***辛酸酷和其它光学活性手性醇的用途。,其特征在于:所述的用途包括下列步骤:(a),离心得到静息细胞;(b)将(a)收获的静息细胞悬浮于缓冲水溶液中,在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下,对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应,制得光学活性手性醇。,其特征在于:所述的步骤(a)-36h,温度20-50°C;以此培养液做为种子,基于发酵培养基体积的接种量体积比为I-10%,接种至发酵培养基中,在20-50°C下100-160rpm培养24-48h,离心得到静息细胞;所述的发酵培养基中各组分的含量如下:葡萄糖10-50g,蛋白胨I-20g,KH2PO4I-10g,K2HPO4I-10g,-2g,-2g,水IOOOmL,pH3-8。,其特征在于:所述的步骤(b)是将步骤(a)获得的静息细胞,-,静息细胞的含量为1-300g湿重/L;在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD+的存在下,在20-35°C和振荡或搅拌下,对潜手性羰基化合物进行不对称还原反应;所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为I-300mmol/L;-60kU/L;-90g/L;NAD+的用量较佳的为0-;-;所述的潜手性羰基化合物为e-***酯或a-***酯类化合物。,其特征在于:所述的潜手性羰基化合物为6-羰基-8-***辛酸こ酯或者如结构式I或2所示的潜手性羰基化合物: