耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析.pdf

该【耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析 】是由【小泥巴】上传分享，beplayapp体育下载一共【10】页，该beplayapp体育下载可以免费在线阅读，需要了解更多关于【耐盐芽孢杆菌R1高效壳聚糖酶异源表达及特性分析 】的内容，可以使用beplayapp体育下载的站内搜索功能，选择自己适合的beplayapp体育下载，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此beplayapp体育下载到您的设备，方便您编辑和打印。万方数据耐盐芽孢杆菌高效壳聚糖酶异源表达及特性分析驤王建荣一,祝木金陈微余思钟斌矗㈣窖,王永华王平曰口锉萻庇口胁幻跆鰏—眩摘要:采用同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶颍⒁煸幢泶镏票钢刈槟脱窝孢杆菌壳聚糖酶,通过表征分析获得重组秆匦浴全长霭被幔结构显示其分为上下两个半球,包含鰀螺旋和隹谡鄣T⒔凸拗校刈楣こ桃一淖罡呙富盍妥艿鞍字手柿颗ǘ确直鹞最适反应和温度分别为和℃,金属离子、和对重组哂屑せ作用。重组钍实孜镂M岩阴6ソ禾蹇蔷厶莏、重组芄桓咝饨禾蹇聚糖并且根据反应时间可以定向制备不同聚合度壳寡糖,,本研究为祷τ锰峁参考。关键词:耐盐芽孢杆菌:壳聚糖酶:毕赤酵母;重组表达:壳寡糖中图分类号:文章编号:—一—鰑叠,鵬埽琖痬.。纯化后的重组簂/≯,,.粢籹甌∥,..深圳润康生态环境股份有限公司,广东深圳;D侠鞹大学食品科学与萄г海愣ü阒;钲谂灯招排┗煞萦邢薰荆愣钲,:仔詂訫T給￡雛Ⅱ凡,詂驧R詏如..鏤—琣甦琫一痬℃,%作者简介:王建荣,男,博士,高级淌Γ妒垦芯可际Γ饕4邮旅窽程及生物催化研究。.,琒,.,收稿日期:——修回日期:一—基金项目:国家“十三五”重点研发计划重点专项项目;㈣。家族壳聚糖酶主要来源于细菌,迄今,已孢杆菌壳聚糖酶基因s,通过毕赤酵母:挢豈以雛帆作为一种生物多糖,几丁质来源广泛,据统计,每年自然界产生的几丁质多达数百亿吨<付≈由于溶解性太差,限制其产业化应用。几丁质脱去乙酰基团形成的壳聚糖可以溶于稀酸,提升其应用价值,但是黏度高、溶水性差等缺点还是限制其进一步推广和应用?。壳寡糖作为壳聚糖的降解产物,聚合度一般在啾扔诳蔷厶牵枪烟蔷哂械黏度、良好的水溶性以及生物可降解性等优势Q究表明,壳寡糖具有抗炎症、抗肿瘤、抑菌、抗氧化等功效,因此可广泛应用于食品、医药、绿色农业种植等领域凇D壳翱枪烟堑闹票阜绞娇煞治;法、物理法和酶法三大类,相比另外两种方法,化学法速度快、成本低,因此产业化应用以化学法为主K孀哦钥枪烟茄芯康纳钊耄嚼丛蕉嗟难芯咳员提倡酶法制备壳寡糖,酶法工艺具有绿色环保、反应过程和产物可控、产物结构完好等优势】。但是较高的生产成本限制了酶法工艺的推广应用,因此降低酶法工艺成本,寻找高效壳聚糖酶具有重要意义。壳聚糖酶能够分解壳聚糖形成壳寡糖,。根据蛋白质结构特性,壳聚糖酶可细分为多个家族,其中家族壳聚糖酶因具有催化效率高、。来源于芽孢杆菌的壳聚糖酶作为家族重要组成部分,前期的研究主要集中在萎缩芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、莫海威芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌,而关于耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶的研究还未有报道。,为其下一步研究和产业化应用奠定基础。菌种、质粒以及试剂耐盐芽孢杆菌掷胱酝寥溃4嬗谝低温冰箱鹤髡咚谑笛槭姨峁淮蟪Ω司鶷感受态细胞:宝日医生物技术本有限公司产品;表达载体⒈铣嘟湍竂:美国赛默飞世尔科技公司产品。限制性内切酶、&罕θ找缴技术本有限公司产品;—鞍字蚀炕约盒:上海生工股份有限公司产品;壳聚糖、氨基葡萄糖、几丁质、木聚糖、羧***纤维素钠:上海源叶生物科技有限公司产品;不同聚合度壳寡糖酆隙夯葜莩ち锛际跤邢薰静罚籗薄层层析硅胶板:德国默克公司产品:其他试剂均为国产分析纯。实验过程中所用的培养基主要包括嘌基、培养基、培养基、培养基和嘌信嘌呐渲凭握涨捌诒ǖ方法【薄仪器与设备牵好拦τ蒙锵低公司产品:凝胶成像系统、电转化仪:美国伯乐公司产品:核酸浓度测定仪:北京百泰克生物技术有限公司产品:发酵罐:镇江东方生物工程设备技术公司产品;紫外分光光度计:日本岛津公司产品:高效液相色谱仪:美国赛默飞世尔科技公司产品。.脱窝挎吒司鶵蔷厶敲富蚩寺〖***治将前期保藏于一℃冰箱的耐盐芽孢杆菌取出活化,以单菌落的形式接人液体培养基进行培养,吸取¨嘌玫木海嫒却后作为┰瞿0濉8菽脱窝挎吒司鶮夯因组中假定壳聚糖酶基因序列虻锹己牛设计一对引物篊方法矗一::耐盐芽孢杆菌高效壳聚糖酶异源表达及特性分析,畂濉.,颿豴∞￡:琱,ⅱ,以质量浓度錖据测序结果获得壳聚糖酶基冈矗筘。通过数据库完成壳聚糖酶基因危筘序列壳聚糖~軱乃庑ЧW芊从μ逑滴●鯻用于┰觥R源砗玫木何@┰瞿0澹过┰龌竦媚勘瓴铮ü碇悄旱缬径目标锝写炕厥眨ù炕厥蘸蟮腜产物送至广州艾基生物有限公司进行测序分析,根耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶蛄蟹治比对分析;通过平台提供的软件完成壳聚糖酶砘灾始盎〗峁狗治觯和ü;通过在线软件狹完成壳聚糖酶模:通过软件瓿煽蔷厶敲窩和底物对接分析:通过软件治隹蔷厶敲峁埂重组工程菌构建及筛选由于在毕赤酵母斫兄刈楸泶铮虼烁荼铣嘟湍该苈胱悠好性进行序列优化。优化后的基因序列白,不含信号肽编码序列贤ㄓ蒙锵低不有限公司合成。合成过程中在繇基因序列两端添加廷粲臝酶切位点,此外去掉矗砘蛐蛄凶陨碇罩姑苈胱樱ê铣傻矗砘蚝驮靥錺“辛臃从Γ竦表达载体猚住=;蟮毕赤酵母惺芴赴坎加赮迮嘌基,℃静置培养。参照前期报道的方法进行筛选实验¨,最终确定鲋刈楣こ叹懈呙芏确⒔培养。高密度发酵高密度发酵培养在⒔凸中进行,实验过程如下:将重组叹缘ゾ形式接人培养基中过夜培养℃魑R患吨肿右海患吨肿右喊%的接种体积分数接入含有嘌摇瓶巾,痬、℃培养至!V荡到嘌玫木喊凑サ慕又痔寤数接入⒔凸拗薪信嘌跏冀锥尾辜痈油作为碳源供菌体生长,当菌体质量浓度跃湿质量计黾又疞,停止流加甘油,开始补加甲醇进行诱导培养:培养过程中每隔⊙行酶活力、总蛋白质质量浓度以及细胞质量浓度的测定,测定过程和前期报道方法一致【。重组掷氪炕懊付ρР问舛重组炕握瘴南住姆椒ń小Mü⒔蜕锨逡进行浓缩。以浓缩好的酶液为对象,利用—白质纯化试剂盒获得纯化后重组2舛ㄖ组圆煌柿颗ǘ冉禾蹇蔷厶的反应速度,,如米氏常数!⒆畲蠓应速度口?等。重组匦圆舛适反应测定如下:在、不同条件下~时为疞乙酸乙酸钠缓冲液,疞磷酸缓冲液舛ù炕笾组富盍Γ握涨捌诒ǖ婪椒ā扑阆喽酶活力;稳定性测定如下:将纯化后重组妗⒉煌琾跫理蟛舛ㄊS嗝富盍ΑV刈镃最适反应温度测定如下:在条件下,测定纯化后重组诓煌露~℃拿富盍Γ握涨期报道方法?计算相对酶活力;将纯化后重组条件下水浴处理螅舛ㄊS嗝富盍Α2煌鹗衾胱佣源炕笾组榷ㄐ杂跋觳握涨捌诒ǖ婪椒á琛R圆同脱乙酰度胶体壳聚糖、几丁质、羧***纤维素钠、木聚糖为底物,分别测定纯化后重组富力,将测得的最高酶活力设置为ィ扑阆喽悦活力。重组馓匦苑治同聚合度壳寡糖嵌侵量橇为底物,%胶体壳聚糖为底物,通过重组煽性制备不同聚合度壳寡糖。首先,摸索不同重组砑恿痬对不同质量浓度胶体在℃、笕⊙蟹治觥F渲水解率和产物组成测定均参照前期报道方法伞其次,在℃、胶体壳聚糖为底物,重组砑恿课痬馕龇从讨兴饴屎筒镒槌啥和凡籸:籘一重组~.处以痙痬反应变化。.痬、,—輈籾。万方数据÷曩薹三丢岳岳岳;丢;粼蓁薹震霞寨薹麟:::酒躅鬻警:;裟:牾歉蟹琐篓嚣皋w篇篇;:::霉嚣黑食品锇尉貉П甑淼期..赗.................日雷..℅,编码霭被帷Mü件げ猓珻分子式为鐷,蛋白质相对分子质量为榷越果显示肟莶菅挎吒司蔷厶敲嗨菩晕%,与萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶嗨菩晕%。比对结果表明粲谔擒账酶家族。将胍丫竦镁宓目蔷厶酶疵咕壳聚糖酶,.涣霉菌狤壳聚糖酶珹;环状芽孢杆菌壳聚糖酶,.豢莶菅挎杆菌壳聚糖酶,.进行比对分析,实验结果如图尽K淙徊煌⑸,根据比对结果以及之前的文献报道旧,推测第位的谷氨酸和第位的天冬氨酸为呋钚晕坏恪4送猓琒一测霭被嵛F淝痹谛藕烹男蛄小以枯草芽孢杆菌壳聚糖酶登录号为D0濉Mü谙呷砑—#竦肅三维构象。和已报道的壳聚糖酶一致,峁钩球状,主要由“螺旋构成,其中“玠钩缮****肭颍下半球主要有、“玜个口折叠构成;上下两个半球由长螺旋“印和壳六糖分子对接由瓿伞S赏芍#孜锝岷锨虺士锥醋刺橇潜话在底物结合区域。由图可知,孜锝合区域与壳六糖之间的作用力主要是氢键,其中多个关键氨基酸在水解过程中发挥重要作用。重组工程菌构建及筛选由于在毕赤酵母薪兄刈楸泶铮虼搜择毕赤酵母最经典的藕烹奶娲鶦自身信号肽。此外通过分析,发现耐盐芽孢杆菌和毕赤酵母密码子偏好性存在差异,因此需要根据毕赤酵母密码子偏好性进行序列优化。通过密码子优化,.ィ咏铣嘟湍父咝П泶镒钍史段约%苈胱邮视弥甘由嵘.,整个过程对黾罨辛擞呕见图。优化后的基因连接至载体癆,获得表达载体茿—良。将表达载体猚觯酝预髓...:、,..巨ⅲ...国....⒛鋂万方数据㈣圜豳霉圜霹豁嘲鬻理盈赭︶馘F黠盹砣︼砼肽垲妙美匦铮毫沓屠啬漩霍茬譬掣列圜陋姻筹****鳓凄圈黼匀锶ι觉铈枕嗄滠菜枇覆茬譬犁列蘧墨副爱盈通莲嘲盈璃圜暖捌:感黼薏删圆圈髓黜裹穗露舞爨戤懿嘲醐阔蕊鳓镯嬲甥嘲蠲蕊糯璃圈圈器:镯嬲盈醐圈舞疆圈燧醐惑霸圈鞠糯砼撼帮砹鼢霍茬譬犁列匿镭黼;圆圈璃镡圈瑶罐蘧簧盈罐罂椭锕理镯蠲匿罐镯焉黜器黔谧驸醚嘲镯翳鳓匿譬霭黼蘧馐闽圜嚣盈圈圈髓盈璃;稠醯裟潮盈圈盈蕊圆圜豳圜盈圜礓翘溜圆盈圈孺勰臣圈盈盈圈:器霍茬譬犁列懿醚餐茬譬犁列霍茬譬犁列霍茬窘犁列篡●赺线性化后转入毕赤酵母竦枚喔鲋刈樽;印养,诱导时间均为∑扛瓷附峁允局刈楣初步筛选挑取个转化子,通过酶活力测定分析,程菌一⒔兔富盍ψ罡痬,其次为最终选取龈呙富盍χ刈楣こ叹分别命名为痬和一痬。一蚥进行复筛。复筛采用摇瓶培重组工程菌高密度发酵选取重组工程菌一懈呙芏确⒔停笛在⒔凸拗薪小S赏芍#谟盏寂嘌螅刈楣こ叹鷅的酶活力、总蛋白质质量浓度和细胞质量浓度均达到最高,分别为疞。相比摇瓶培养,重组工程菌一⒔凸薹⒔秃蟮拿富盍μ嵘倍。由图可知,发酵上清液中存在两条主要蛋白质条带,相对分子质量分别约为×.,推测相对分子质量×醮怯傻鞍字史牍程中糖基化形成的。由图可知,重组去糖基化后只剩下一条相对分子质量约为×条带,表明重组嬖谔腔奘巍4送夥⒔蜕清液中基本为重组见图峁党聚栅緾‘沉羌岚党聚槲’,鱚—瞚瞮万方数据食品锇尉貉П甑淼期囊羹分离纯化、。最大反应速度%。为¨·砻髦刈镃能够高效水解壳聚糖。温度特性重组露忍匦匀缤所示,由图可知,重组钍史从ξ露任,在~℃时相对酶活力均大于%。由图可知,重组媸本哂辛己玫奈榷ㄐ裕处理螅S嗝富盍笥ィ贝砦露却于℃,剩余酶活力急剧下降,重组℃水浴处理螅S嗝富盍鑫ァS醒究报道萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶猄薄⒔獾矸垩孢杆菌壳聚糖酶【¨虰“℃热处理螅S嗝富盍Ψ直鹞%、%和%。相比于上述芽孢杆菌壳聚糖酶,:耐盐芽孢杆菌高效壳聚糖酶异源表达及特性分析图刈榫鷅在⒔凸薹⒔颓呒安煌稴—蛋白质电泳表重组付ρР问温度对重组挠跋渤￥世兴蚓筐瞪趟啪呙芏确⒔颓煌⒔褪奔涓呙芏确⒔蜕锨逡旱皉实缬刈:去糖基化蛋白质电泳狿一反应温度/钍史从ξ露藻热处理温度/。任榷ㄐ图万方数据鱆熊舻时眕肼孵重组膒匦匀缤所示,由图芍#刈镃最适反应为。由图芍#刈镃在~时具有良好的稳定性,室温放置螅S嗝富盍笥%。重组膒匦杂胍驯ǖ赖募J暇壳聚糖酶相似。不同金属离子对重组榷ㄐ杂跋烊表尽虲灾刈镃具有激活作用,其中效果最好。在/跫拢“、和处理组剩余酶活力分别为%、%和%;在/跫拢琈处理组剩余酶活力分别为%、%和%。金属离子、和对重组具有抑制作用,其中的影响最大。当离子浓度为/·陛重组孜锾匾煨匀绫所示,重组欢越禾蹇蔷厶蔷哂兴饣钚裕渲卸酝乙酰度%胶体壳聚糖表现出最高水解活性。重组苑勰┘付≈省⒔禾寮付≈省Ⅳ燃谆宋钠以及木聚糖均没有活性。重组獠煌酆隙瓤枪烟鞘笛榻果如图荆刈镃对壳二糖和壳三糖没有水解活性,反应螅嵌呛涂侨蔷挥斜分解成更小的糖。;?ú孔;?嵌呛涂侨糖,壳六糖则全部转化为壳二糖、壳三糖和壳四糖。在所有的反应过程中均没有出现单糖,表明重组且恢帜谇锌蔷厶敲浮4送猓谒械姆从特性金属离子特性/脱乙酰度%胶体壳聚糖粉末几丁质胶体几丁质木聚糖羧***纤维素钠水解特性图刈镃最适反应和稳定性表煌鹗衾胱佣灾刈镃稳定性影响表刈镃底物特异性瑕。—钍史从榷ㄐ..±±.:—瞚瞮“万方数据■■■■■■■■■觥觥觥觥觥觥觥鯻食品锇尉貉П甑淼期壳笺囊蹴囊美禧蠢蹉禧壳兰禧囊翌禧配体系中均没有出现比初始底物聚合度更高的壳寡糖,表明重组痪哂凶L擒彰富钚浴刈镃水解壳聚糖制备不同聚合度不同酶添加量对不同质量浓度~痙底物的水解效果如图尽5孜镏柿颗ǘ任痙⒚添加量在痬保从螅獠镏饕由壳二糖和壳三糖构成,含有少量壳四糖:当酶添加量为痬保獠镌蚧疚?嵌呛涂三糖。底物质量浓度的水解结果相似,当酶添加量为痬保解产物主要为壳二糖、壳三糖、壳四糖和壳五糖,包含少量壳六糖;当酶添加量大于痬獠则主要由壳二糖、壳三糖和壳四糖构成根据不同酶添加量水解不同质量浓度胶体壳聚糖实验结果,进一步研究痬柑砑恿克痙禾蹇蔷厶欠从讨胁镒槌珊退饴剩实验结果如图尽7从螅獠镉壳二糖至壳六糖构成,其中壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖的质量浓度分别为/,,壳二糖、壳三糖和壳四糖的质量浓度以及水解率逐渐增加7从χ保獠镏饕S煽嵌恰⒖侨糖、壳四糖和壳五糖构成。迄今,已有多种酶用于制备壳寡糖,根据酶的种类可以分为专一性酶蔷厶敲和非专一性酶ü好浮⑾宋孛浮⒅久傅。由表芍#壳聚糖酶水解效率明显优于非专一性酶,此外重组庑视庞谝驯ǖ赖亩嘀挚蔷厶敲浮通过同源克隆获得耐盐芽孢杆菌壳聚糖酶基因觯没蛉ǔの,编码霭基酸,其中前个氨基酸为其潜在信号肽序列,序列比对结果表明壳聚糖酶粲谔擒账酶家族。以毕赤酵母K拗鳎刈楸泶锟蔷糖酶⒔凸尢跫拢刈楣こ叹壳寡糖痙和图王建荣,等:耐盐芽孢杆菌高效壳聚糖酶异源表达及特性分析分别为反应标准品图重组獠煌酆隙瓤枪烟遣锓治痙禾蹇蔷厶侵柿颗ǘ妙单糖.、标准自禾蹇蔷厶侵柿颗ǘ∥禾蹇蔷厶侵柿颗ǘ直鹞C柑砑恿、、、、痬狈⒔鸵骸重组獠煌柿颗ǘ冉禾蹇蔷厶遣颰分析清壳二糖壳壳四糖壳五糖壳六糖嵌壳三糖标准撬奶标准晶俏逄橇标准糖壳准标,口万方数据—、■团圆■■圈固盈守孝掌零﹍————————孝彳≯警粪参考文献:如眠懈一罡呙富盍ξ痬4送馔ü鞍字蚀化以及酶动力学参数测定发现重组资常数N./,最大反应速度∥。。为¨·砻髦刈镃对壳聚糖具有良好的亲和力和水解活性。重组℃具有良好的活性和稳定性。重组特性表明其是一种内切壳聚糖酶。重组够高效水解痙禾蹇蔷厶牵柑砑恿条件下,反应蔷厶撬饴时愦锏%,表明重组视糜诳枪烟堑拿阜ㄖ票福乱徊讲祷τ玫於ɑ 交琩禾蹇蔷厶堑乃獠颰分析、壳寡糖质量浓度以及水解率重组巴伦氏类芽孢杆菌壳聚糖酶解淀粉芽孢杆菌壳聚糖酶萎缩芽孢杆菌壳聚糖酶商业果胶酶商业脂肪酶商业木瓜蛋白酶商业纤维素酶壳聚糖质量浓壳聚糖脱乙酰∥∥反应时间/Ⅱ瓼县释图煌从κ奔湎轮刈镃水解表阜ㄖ票缚枪烟度/%痬琒猄琫,,琖唬瑂:单糖壳二糖壳■糖壳四糖壳五糖壳六糖赵燃馏喀囊谍根反应时间/分析枪烟侵柿颗ǘ垛根饴堪,痙Ⅱ色..,,—:∞品、准***际、勾日—瞚瞮享摹琇万方数据吉品ノ锇吻笱П甑淼期“胁。加舒詂删“.,,:∽,,.狥鄌甒瓻,四矗::耐盐芽孢杆菌高效壳聚糖酶异源表达及特性分析—瓼琇—踅ㄈ伲P〗穑跗剑龋跹挎吒司鶵壳聚糖酶高效制备及特。陆表征称酚敕⒔蚑担:—.琖鱎瓼瓸珻—,蒮删瑉琎琫,,王建荣,刘丹妮,夏雨,⒔汀荆阂担阹印加,琧叭:..:琙甀瓼,,:琇—:瓸:.瓼,,—!R瞨:.甊篴,:琓甊厅鐃琕:珺瓹衞:瑉適拧皊“唧以瑉.—..,,.琗如∽,。,,:琘——..∽辬盛琕甈野瓻,:.瑇琕