利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数.docx

该【利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数 】是由【老狐狸】上传分享，beplayapp体育下载一共【9】页，该beplayapp体育下载可以免费在线阅读，需要了解更多关于【利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数 】的内容，可以使用beplayapp体育下载的站内搜索功能，选择自己适合的beplayapp体育下载，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此beplayapp体育下载到您的设备，方便您编辑和打印。利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数魏毅东;罗曦;吴方喜;林悦龙;何炜;连玲;谢华安;张建福【摘要】水稻转化过程中,,(bar)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2,***转移酶OsPIMT1转基因T0代植株进展了荧光定量分析,其中6个为单拷贝,3个为双拷贝,经过Southern杂交和分别比分析验证,说明该方法能够快速,准确的鉴定水稻含有草铵膦抗性基因的水稻转基因植株.【期刊名称】《福建稻麦科技》【年(卷),期】2023(035)004【总页数】4页(P39-42)【关键词】水稻;转基因;草铵膦抗性基因(bar);甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2;实时定量PCR;拷贝数【作者】魏毅东;罗曦;吴方喜;林悦龙;何炜;连玲;谢华安;张建福【作者单位】福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻争论所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创与分子育种重点试验室/福州(国家)水稻改进分中心/福建省作物种质创与分子育种省部共建国家重点试验室培育基地/杂交水稻国家重点试验室华南争论基地/福建省作物分子育种工程试验室/福建省水稻分子育种重点试验室,福建福州350003【正文语种】中文【中图分类】S511;Q78植物转化已经广泛应用于植物功能基因争论与作物品种改进。目前常用的农杆菌介导的转化法,由于片段是随机插入到基因组中,当多个片段重组到基因组中将影响外源基因的表达,甚至会造成外源基因沉默[1],且不利于后续的遗传分析。为了获得单一插入片段的转基因植株,早期的争论人员不得不依靠于费时费力,且需要大量基因组DNA的Southern杂交法进展拷贝数鉴定。随着实时荧光定量PCR〔RealTimeFluorescenceQuantitativePCR,qPCR〕技术的不断进展,其已经成为快速、灵敏、高效的拷贝数鉴定方法。目前,qPCR技术已经被用于转基因棉花,小麦,玉米等作物的拷贝数鉴定[2-4]。本争论选取保守的单拷贝基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2作为内参基因[5,6],利用基于2-ΔCT相对定量法的荧光定量PCR技术,建立了快速,高效的不依靠于标准曲线的水稻除草剂草铵膦抗性基因的拷贝数分析体系,从而简化了转基因水稻拷贝数鉴定的流程并提高了检测通量。材料与方法材料质粒模版:pOE-PIMT1〔含有草铵膦抗性基因bar〕,GAPDH2基因PCR产物和UBQ5基因PCR产物。水稻材料:籼稻航2号比照,含有bar基因的OsPIMT1转基因克隆,依次命名为AL1~AL9。引物设计与合成水稻内参基因UBQ5,GAPDH2和抗性基因bar的引物使用Primerpremier5软件设计,由铂尚生物技术〔上海〕合成。bar基因:上游引物:ACTAC,TG;GAPDH2基因:上游引物:TATGATCAGATT,下游引物:TTGAGTTT;UBQ5基因:上游引物:ACTACT;下游引物:TGCTGGTT。基因组DNA提取承受CTAB法提取水稻叶片DNA[7],对提取的DNA进展琼脂糖电泳以及紫外分光法检测,保证DNA未降解且无杂质污染。荧光定量PCR扩增实时定量PCR反响在96孔板中进展,50μL反响体系包含以下成分:25μL2×FastStartUniversalSYBRGreenMaster〔ROX〕,,5μL稀释的DNA〔50ng/μL〕。反响条件:95℃预变性10min;95℃变性15s,60℃退火延长60s,40个循环。反响完毕后依据ABI7500仪器标准程序进展溶解曲线分析。内参基因ubc5和外源基因bar标准曲线制作以含有草铵膦抗性基因bar的质粒pOE-PIMT1作为标准品,将其进展5×梯度稀释,浓度分别为10pg/μL,2pg/μL,,80fg/μL,16fg/μL。同时以GAPDH2和UBQ5基因的PCR产物为标准品,,,20f/μL,4pg/μL,。,最终分别制作标准曲线。转基因水稻中内参基因和外源基因的定量分析利用已验证的含bar基因的纯合单拷贝株系的gDNA用作参比模版,9个PCR阳性的OsPIMT1转基因克隆植株以及亲本航2号的gDNA为待测样品模板,以内参基因与抗性基因的检测引物进展qPCR检测,所得CT值利用2-△△CT法进展定量分析。转基因植株的Southern杂交分析将提取的水稻gDNA利用PstI〔Takara〕进展酶切〔时间6h,温度37℃,体积250μL,gDNA150μg〕。待酶切完毕后,-20℃放置30min,于16000g低温离心10min。吸弃去上清后,参与55μLddH2O溶解DNA,将溶解的DNA与6μL10×DNAloadingbuffer混合后上样电泳。电泳参数为:%琼脂糖,,直至溴酚蓝指示带跑至底部位置。参照分子克隆第三版[8],承受毛细管向上转膜法进展DNA印迹,杂交、探针制备和显色使用AlkPhosDirectLabelingandDetectionSystem〔Amersham〕进展,操作步骤参照厂家说明书。转基因后代的分别比分析籼稻航2号种子和T1代转基因种子经过1d浸种后,用湿布包裹于37℃催芽。将发芽的种子播种到盆土中,待第2片叶完全开放后喷施500mg/mL草铵膦,5d后将幼苗取出,统计死亡和存活的幼苗数量,所得数据用SPSS19进展卡方统计分析。结果与分析荧光定量扩增曲线与溶解曲线个基因bar,UBQ5和GAPDH2的扩增曲线如图1所示,结果说明扩增曲线平滑,扩增稳定。同时我们对扩增产物进展溶解曲线测定,bar、℃,℃,℃,溶解曲线均为单一峰,说明引物的特异性较强,在反响中无引物二聚体等非特异性扩增,适合用于qPCR分析。图1bar,UBQ5,GAPDH2基因扩增曲线与溶解曲线荧光定量标准曲线以起始模板拷贝数的对数为纵坐标,CT值为横坐标绘制标准曲线,分别获得bar,UBQ5和GAPDH2的标准曲线〔图2〕。由于2-ΔΔCT对两个基因的扩增效率要求很高,需要扩增效率全都,而bar基因引物和GAPDH2引物扩增效率相近,约95%,符合试验要求,因此选取GAPDH2这个内参基因用于后续的拷贝数分析。图2内参基因UBQ5和GAPDH2与外源抗性基因bar的标准曲线基于2-ΔΔCT鉴定T0代转基因水稻的拷贝数将所提DNA用于荧光定量PCR分析,由于待测样品为T0代植株,因此其插入位点为杂合型,纯合单拷贝比照样品的RQ值应为T0代单拷贝植株RQ值的2倍,而与双拷贝植株的RQ值相等。通过2-△△CT法将全部样品与纯合单拷贝的参比比照进展比较,结果说明L1,L2,L4,L5,L6,L8为单拷贝植株,而L3,L7,L9为双拷贝植株,其余植株为单拷贝转基因植株〔图3〕。图3荧光定量鉴定转基因材料拷贝数注:CK:单拷贝纯合比照植株;WT:航2号植株;L1~L9:转基因植株转基因水稻southern杂交验证与分别比分析从9个转基因克隆中选取5个转基因植株进展Southern杂交拷贝数验证,结果说明L1,L2,L4和L5为单拷贝植株,而L3为双拷贝植株〔图4〕,这与qPCR结果完全全都。为了进一步验证qPCR所得的拷贝数结果,对T1代转基因进展草铵膦筛选,阴性与阳性植株数量进展卡方分析,单拷贝植株符合1/3分别比,双拷贝植株符合1/15分别比〔表1〕。图4转基因植株的Southern杂交检测注:Plasmid:pOE-PIMT1质粒;WT:航2号植株;L1,2,3,4,5,5:,由于当时基因组测序尚未完成且水稻组培转化的难度较大,需要Southern杂交鉴定转化大事和拷贝数分析。随着基因组测序的技术的快速进展,很多植物,包含水稻的全基因组序列都已测序完成,内源基因的拷贝数以及序列构造都已格外明确。利用荧光定量PCR技术,借助于基因组数据选取适宜的内参基因能够准确确定转基因作物对的拷贝数。近年的争论结果说明,Southern杂交所得的拷贝数并不准确[9-11]。排解Southern杂交试验误差,如Southern杂交中酶切不完全,不同片段转膜效率不同等因素;农杆菌介导的水稻转化本身存在不确定性,会发生大量的基因重排或片段重组[12],可能导致插入位置四周区域大片段的复制或局部重组的发生,因此需要其他方法进一步验证Southernblot拷贝数[13]。此外,由于本争论承受2-△△CT法而不依靠于非标准曲线法,提高了检测效率和通量,但应尽可能排解样品方面的影响,需要样品纯度较高,扩增体系要相对稳定,重复性好。经过2-△△CT法计算,单拷贝,,。实际定量过程中,~,~,~。因此,,否则结果难以确定。虽然本争论选用了bar基因进展检测,但只要更换外源基因引物即可检测潮霉素抗性基因HPTII,霉素抗性基因NPTII等多种抗性基因。参考文献[1]Stam,M.,,,Reviewarticle:thesilenceofgenesintransgenicplants[J].AnnalsofBotany,1997,79〔1〕:3-12.[2]李淑洁,-TIMEPCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数[J].中国生物工程杂志,2023,30〔3〕:90-94.[3]杨晓杰,刘传亮,张朝军,[J].农业生物技术学报,2023,19〔2〕:221-229.[4]Shepherd,.,,,Determinationoftransgenecopynumberbyreal-timequantitativePCR[J].TransgenicMaize:MethodsandProtocols,2023:129-134.[5]魏毅东,陈玉,郭海萍,-PCR的内参基因的选择[J].农业生物技术学报,2023,21〔11〕:1302-1312.[6]Jain,M.,,,-timePCR[J].munications,2023,345〔2〕:646-651.[7]Porebski,S.,,,ModificationofaCTABDNAharideandponents[J].Plantmolecularbiologyreporter,1997,15〔1〕:8-15.[8]DY,,MolecularCloning-ALaboratoryManual〔分子克隆试验指南〕.2023,2nd,Beijing:SciencePress.[9]Ingham,.,,,-timePCRassayfordeterminingtransgenecopynumberintransformedplants[J].Biotechniques,2023,31〔1〕:132-141.[10]Livak,.,,Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2-ΔΔCTmethod[J].methods,2023,25〔4〕:402-408.[11]Faize,M,,,oandapricotandtomonitortheirdissociation[J].BMCBiotechnol,2023,10:53.[12]Jeon,,,,‐DNAinsertionalmutagenesisforfunctionalgenomicsinrice[J].ThePlantJournal,2023,22〔6〕:561-570.[13]Mason,G.,,,-timePCR[J].BMCbiotechnology,2023,2〔1〕:20.