分子生物学实验报告.docx

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班级:***指导教师:**学生姓名:***名目:试验一质粒DNA的小量制备试验二DNA的含量、。为提高学生在分子生物学技术方面的动手力气,生物技术综合试验室主要开设常用而根本的分子生物学试验技术。它的内容包括质粒DNA的制备;DNA的重组;PCR基因扩增等等。试验一质粒DNA的小量制备一、试验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进细胞中去进展生殖和表达,需要运载工具,携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体〔vector〕。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必需具备以下条件:(1)是一个复制子,载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制生殖;〔2〕载体在受体细胞中能大量增殖,只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增〔;3〕载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点,便于外源基因的插入〔;4〕载体具有选择性的遗传标记,如有抗四环素基因〔Tcr〕,抗霉素基因〔Ner〕等,以此知道它是否已进入受体细胞,也可依据这个标记将受体细胞从其他细胞中分别筛选出来。细菌质粒具备上述条件,它是基因工程中常用的载体之一。质粒〔plasmid〕是一种染色体外的稳定遗传因子,大小在1~120kb之间,具有双链闭合环状构造的DNA分子,主要觉察于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录力气,能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数,可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内,也可以整合到细菌染色体中,它离开宿主的细胞就不能存活,而它把握的很多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制,一般分为两种类型:严密把握型〔stringentcontrol〕和松弛把握型〔relaxedcontrol〕。前者只在细胞周期确实定阶段进展复制,染色体不复制时,它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制,在细胞里,它有很多拷贝,一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等,拷贝数较少,复制受到严格把握。小的质粒,如ColEⅠ质粒〔含有产生大肠杆菌素E1基因〕,拷贝数较多,复制不受严格把握。在使用蛋白质合成抑制剂-***霉素时,染色体DNA复制受阻,而松弛型ColEⅠ质粒连续复制12-16h,由原来20多个拷贝可扩增至1000-3000个拷贝,此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2%增加到40%-50%。本试验分别提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。全局部别质粒DNA的方法都包括三个根本步骤:培育细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分别和纯化质粒DNA。承受溶菌酶可破坏菌体细胞壁,十二烷基硫酸钠〔SDS〕可使细胞壁解,经溶菌酶和阴离子去污剂〔SDS〕处理后,细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106-107范围内,×106,×106。在细胞内,共价闭环DNA〔covalentlyclosedcircularDNA,DNA〕常以超螺旋形式存在。假设两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消退链的张力,这种松弛型的分子叫做开环DNA〔opencircularDNA,简称ocDNA〕。在电泳时,DNA形式存在,它比其开环和线状DNA的泳动速度快,因此在本试验中,自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、试验目的把握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。了解制备原理及各种试剂的作用。三、试验材料和试剂材料:,含pBR322质粒。试剂:LB培育基:10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,10g/LNaCl,。如固体培育基则添加15g/L琼脂。溶液Ⅰ〔〕:50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HC,l10mmol/LEDTA。灭菌后存放。溶液Ⅱ〔(内含1%SDS)〕:预先配制1%SDS母液,,4℃保存。溶液Ⅲ〔〕:5mol/L乙酸钾60mL、、。酚/***仿液(V/V=1/1):酚为重蒸酚,配制时,先将***仿中参与异戊醇,使其体积比为24:1,然后等量的参与重蒸酚,混匀,-HCl()抽提几次以平衡这一混合物,于棕色瓶中存放,-HCl(),4℃保存。%:10mmol/LTris-HC、l1mmol/LEDTA,其中含RNA酶20μg/mL。仪器:恒温培育箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管()、加样器(20uL~lmL)、吸头。四、操作步骤〔一〕培育细菌将带有质粒pBR322的大肠杆菌接种在含50μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB液体培育基中,37℃振荡培育过夜。留意:添加Amp时,须待LB培育基冷却到50℃左右方可参与。〔二〕,7500rpm离心1min。弃上清,参与150μL GET缓冲液,在涡旋混合器上充分混匀,在室温下放置10min。(内含1%SDS),加盖,颠倒〔不要振荡〕2~3次,使之混匀,冰上放置4min,最多不能超过5min。参与150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后,颠倒数次使之混匀,冰上放置15min。℃,10000rpm离心5min,,如上清液浑浊则需重离心一次。于上清液中加等体积酚/***仿液,振荡混匀,4℃,12023rpm离心2min,留神吸取上清液,,留意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。向上清液参与2倍体积无水乙醇,混匀,室温放置3min。用离心机于10000rpm离心5min。小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使全部液体流出。%乙醇洗涤沉淀一次,10000rpm离心3min,除尽乙醇,室温自然枯燥(将离心管倒置于一张纸巾上),备用。用25uL含无DNA酶的胰RNase(20ug/mL)的TE重溶解DNA,置于4℃保存,供下午电泳使用。贮存于-20℃备用,可长期保存。五、留意事项收集菌体提质粒前,培育基要去除干净,同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合确定要严峻,承受上下颠倒的方法,千万不能在旋转器上猛烈振荡。其中参与溶液Ⅱ后,溶液变成澄清,并有黏性;参与溶液Ⅲ后,消灭絮状沉淀。苯酚具有腐蚀性,能造成皮肤的严峻烧伤及衣物损坏,使用时应留意。如不留神皮肤上遇到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。苯酚可以用于抽提纯化DNA,由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必需经过重蒸,-HCl()层溶液,由于上层是Tris-HCl液隔绝空气层。行平衡。所以取酚/***仿/异戊醇时应取下酚/***仿/异戊醇抽提时,应充分混匀。经酚/***仿/异戊醇抽提后,吸取上清液时留意不要把中间的白色层吸入,其中含有蛋白质等杂质。试验中,涉及酚/***仿溶液的操作要格外留神,而且与之接触的吸头、Ep管,全部弃用,不回收。有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在,但经过屡次移接有可能造成质粒丧失。因此不要频繁转接,每次接种时应挑单菌落。六、思考题裂解细菌时需留意的事项有哪些?答:留意不能震荡,防止细菌DNA断裂,混到质粒里面去,导致提取的质粒不纯。质粒的根本性质有哪些?答:质粒的性质:原指一切独立于染色体外的遗传因子,但目前一般指微生物细胞中的染色体外遗传因子。它们是能自主复制的共价、闭合、环状的DNA分子,整个质粒通常编码假设干个基因。由于质粒的存在往往可以使宿主细胞具有某些性状,而质粒的丧失并不影响宿主在正常条件下的生存。由质粒授予宿主的表型有抗生素耐药性的、产抗生素的、降解芳香族化合物的、产溶血素的、糖发酵的、对重金属耐受性的、产杆菌素的、植物肿瘤诱发的和产硫化氢的。依据质粒的复制类型分为松弛型复制(胞内维持高拷贝数,从几个到几十个)和严聚紧型复制(胞内仅1~3个拷贝)。一局部质粒可通过细菌细胞的接触而转移,使一些对药物敏感的细胞获得对某些药物、金属离子的耐受性或使受体细胞获得另一些特性。在基因重组技术中,有些质粒可用作基因载体。现在应用的载体根本上是在质粒的根底上改造而成的。3、碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么?答:各溶液的作用如下:溶液Ⅰ葡萄糖增稠,使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以参与RNase,不受EDTA影响,并且可以在后续步骤中被除去溶液Ⅱ%SDS破细胞的主要是碱,而不是SDS,所以才叫碱法抽提。溶液Ⅲ3M醋酸钾/2M醋酸这一步的K置换了SDS〔十二烷基磺酸钠〕中的Na,得到PDS〔十二烷基磺酸钾〕沉淀;SDS易与蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大局部蛋白质也沉淀了,同时基因组DNA也被PDS共沉淀4、抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤?答:DNA提取分为三个根本步骤:1、裂开细胞,并通过参与去污剂以除掉膜脂。2、醋酸盐沉淀,或者酚/***仿抽提,以除掉细胞内的蛋白,如与DNA结合的组蛋白。3、将DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀,由于DNA在醇中不行溶而黏在一起,这一步也能除掉盐分。如何提高质粒DNA的产量?答:提取方法都是大同小异的,只要操作上留意量都不会差异很大。所以主要还是看菌液的状态。假设想抽多一些,就摇多些菌液,一般假设是大质粒,用5ml以上菌液摇,屡次离心用一管收集,相应增加溶液一二三的量即可。另外,一般认为,一般摇16个小时菌的生长状态比较好。为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置?为到达这一目的,需要留意些什么?答:将质粒DNA反复在4℃、-20℃、室温中放置会导致环状的DNA的断裂成线性的分子,不能得到环状的DNA分子。所以为了避开这一问题对于提取的DNA因依据使用其的时间不同而作区分地处理:对于近段时间就要用的质粒DNA应置于4℃冰箱中放置;而对于长时间不用的质粒DNA,则应保存在-20℃的冰箱中,由于在相对低的温度下质粒可以保存较长的时间。试验二DNA含量、纯度与分子量的电泳法测定一、 试验原理测定核酸通常承受两种方法:即紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳法。紫外分光光度法DNA或RNA定量时,应在260nm和280nm两个波长下读数。依据计算在260nm波长下,每1ug/,即在A=1时,双链DNA含量为50ug/mL,单链DNA与RNA含量为40ug/mL,单链260寡核苷酸的含量为33ug/mL。双链DNA含量=A×50×稀释倍数〔ug/mL〕260RNA含量=A×40×稀释倍数〔ug/mL〕260单链DNA含量=A×33×稀释倍数〔ug/mL〕260此外还可以依据260nm和280nm的读数间的比值〔A/A〕估量核酸的纯度。琼脂糖凝胶电泳法260280依据DNA分子量不同,承受外加电场使其分开,用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量,如将浓度的标准样品表2-1作为电泳比照,就可以估量出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照,只需要5-10ngDNA,就可以从照片上比较鉴别。由于电泳时所用的样品量格外少,只要将浓度把握在几十纳克即可,所以在基因工程中常常被用做检测DNA样品。表2-1 λDNA/HindⅢ中DN***断片段碱基对数目/kb相对分子质量DNA含量/%DNA含量/(ng/mg)××××××××、试验目的从以上试验中提取到的质粒DNA,为了能作下一步的酶切,连接及转化试验,必需测定DNA的纯度、含量以及分子量大小。本试验旨在学****水平式琼脂糖凝胶电泳,学****检测DNA、含量与相对分子质量大小。三、试验材料和试剂材料:自制的质粒DNA、λDNA/HindⅢ、。试剂:(λDNA/HindⅢ)Ⅰ或HindⅢ和10X缓冲液酶反响中止液:%溴酚蓝(含40%蔗糖),已配好。溴化乙锭染液〔EB〕:使用前稀释1000倍,母液已配好。留意:EB是一种诱变剂,配制和使用时应戴好手套,并且不能将该染液洒在桌面或地面上!使用后马上用大量的水冲洗干净。×TBE缓冲液:、、EDTA-。可配成25×TBE母液,使用时稀释10倍即可。%琼脂糖仪器:37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管()、加样器(20uL~lmL)、吸头。四、试验操作〔一〕,在10uL的体系中用单一酶〔如EcoRⅠ〕进展处理,即:质粒DNA 5μL10×缓冲液 1μLEcoRⅠ ℃,保温30min。,混匀以停顿酶解反响。各酶解样品于冰箱中贮存备用。〔二〕,置于锥形瓶中,参与100mLTBE缓冲液,瓶口倒扣一小烧杯,于电炉上加热,留意:防止溢出,由于琼脂糖较难溶解,假设水分损失较大,则补充确定量的蒸馏水,使其终浓度为1%。、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好,形成一个边脚模子。留意:将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上,不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置,放好样品槽模板(一般称之为梳子),将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶,留神地倒在内槽上,把握灌胶速度,使胶液缓慢地开放,直到整个有机玻璃板外表形成均匀的胶层。室温下静置1h左右,待凝固完全后,轻轻拔出样品槽模板,撕去胶带纸,胶板上即形成相互隔开的样品槽。将有机玻璃内槽放入电泳槽中,×TBE电泳缓冲液,以盖过胶板为宜。加样胶板内的样品小槽用微量加样器将上述样品分别参与胶板的样品小槽内,每次加完一个样品为了避开穿插污染,各样品用不同的吸头,以免造成限制酶被污染。加样时,吸头不要插入胶板内,防止碰坏样品槽四周的凝胶面,每个样品槽的加样量不宜过多,本试验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker,这里即为λDNA/HindⅢ)电泳加完样品后应马上通电,进展恒压电泳。在低压条件下,线形DN***段的迁移速度与电压成比例关系,为了获得电泳分别DN***段的最大区分率,电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝染料〔蓝色〕移动到距离胶板下沿约1~2cm处,停顿电泳。染色将电泳后的凝胶浸入EB染液中,进展染色以观看在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后,用大量水冲洗。观看在波长为254nm的紫外灯下,观看染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。用凝胶自动成像仪处理代替。五、留意事项基因工程是微量操作技术,DNA样品与限制性内切酶的用量都极少,必需严格留意吸样量的正确性,确认样品确实被参与反响体系。酶应在-20℃冰箱中保存,取酶的操作必需严格在冰浴条件下进展,用完后马上放回-20℃冰箱,不要将酶在冰浴中放置过久,或放在高于0℃以上的环境中,以防止酶失活。、缓冲液和DNA,然后混匀。酶永久是最终参与的,如将酶直接参与浓缩的缓冲液中会引起严峻的失水。酶切反响体系的溶液加完后,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底,不要用振荡器。此步操作是整个试验成败的关键,留意防止错加、漏加。,各样品用不同的吸头,且每次取酶时务必换吸头,以免造成限制酶被污染。,有毒性,使用含有这种染料的溶液时,应戴手套进展操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上,用后用水彻底冲洗干净。六、思考题简述EB显色的原理。答:琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进展染色,溴化乙锭含有一个可以嵌入DNA积存碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱和溶液中,。当染料分子插入后,其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定位置及其与碱基的亲热接近,导致与DNA结合的染料呈现荧光,其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。DNA吸取254nm处的紫外辐射并传递给染料,而被结合的染料本身吸取302nm和366nm的光辐射。这两种状况下,被吸取的能量在可见光谱红橙区的590nm处重放射出来。由于溴化乙锭-DNA复合物的荧光产率比没有结合DNA的染料高出20-30倍,所以当凝胶中含有游离的溴化乙锭〔〕时,可以检测到少至10ng的DNA条带。溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸〔DNA或RNA〕。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小,所以其荧光产率也相对较低。事实上,大多数对单链DNA或RNA染色的荧光时通过染料结合到分子内形成较短的链内螺旋产生的。使用溴化乙锭时应留意什么?答:溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性!没方法的,只能带手套和自己留神,而且做完之后要做如下处理试验完毕后,应对含EB的溶液进展净化处理再行弃置,以避开污染环境和危害人体安康。,可如下处理:①;②,混匀,再参与等量的25mol/LHCl,混匀,置室温数小时;③,混匀并废弃。:①按1mg/ml的量参与活性炭,不时轻摇混匀,室温放置1小时;②用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。说明不同电压对电泳结果的影响是什么答:在低电压时,线状DN***段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加,不同分子量的DN***段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强上升引起的迁移率上升幅度也越大,因此电压增加,琼脂糖凝胶的有效分别范围将缩小,也会产生拖尾现象。但电压过低,DNA移动速度会很慢,电泳时间较长。所以实际做电泳试验时应依据不同DN***段和试验要求选择适宜的电压。通常使用的电泳电压为90~120V。如何推断DNA的纯度?答:测定DNA浓度与纯度利用紫外可见分光光度计分别测定在波长260nm处、280nm处DNA的吸光率,然后计算其浓度与纯度。对于纯的核酸溶液,测定A260,即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量。核酸的比吸光系数是指浓度为1ug/ml的核酸水溶液在260nm处的吸光率,,变性DNA〔即单链DNA〕。DNA纯度可以A260/A280的比值表示:,。核酸样品中假设含有蛋白质或苯酚等杂质,此比值则显著降低。