凡口铅锌矿酸性底泥可培养微生物资源的探索分离.docx

该【凡口铅锌矿酸性底泥可培养微生物资源的探索分离 】是由【科技星球】上传分享，beplayapp体育下载一共【15】页，该beplayapp体育下载可以免费在线阅读，需要了解更多关于【凡口铅锌矿酸性底泥可培养微生物资源的探索分离 】的内容，可以使用beplayapp体育下载的站内搜索功能，选择自己适合的beplayapp体育下载，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此beplayapp体育下载到您的设备，方便您编辑和打印。凡口铅锌矿酸性底泥可培养微生物资源的探索分离??房保柱,王怡欢,张堃,廖俊杰,欧阳欣,岳秀,肖吉,李文均*(,广东广州510275;,广东广州510300)(N25°2′″,E113°39′″),如图1所示。凡口铅锌尾矿5个采样点采集表层5cm的底泥样品各10份,每个样品分别由5个金属钻孔获得的样品(呈圆周分布)混合而成。样品采集后,立即放入已灭菌的玻璃血清瓶中,置于冰盒中保存,送回实验室于4℃冰箱中保存,备用。-ZincMine,(表1)。经过筛选与优化确定3种培养基用于微生物的纯培养:①改良ISP2培养基(3号培养基)[15](g/L),,;②改良FeO(9号培养基)固体培养基,,;③改良9K(12号培养基)培养基[16]。所有培养基均加入100mL采样点酸性废水原液过滤液()。(inductivelycoupledplasmaopticalemissionspectrometry,ICP-OES;Optima2100DV;珀金埃尔默,马萨诸塞州,美国);原子荧光谱法(atomicfluorescencespectrometry,AFS;AFS-820;Gi-Tian,北京,中国);光电子能谱(X-rayphotoelectronspectroscopy,XPS);StarPrepGelExtractionKit胶回收试剂盒(GenStar北京康润诚业生物科技有限公司);pMDTM18-TVectorCloningKit(TakaraBio宝生物工程(大连)有限公司);便携式pH计(HACH,5055)。:A、C液121℃灭菌20min,B液过滤,:无菌条件下,()的三角瓶,放入数粒玻璃珠,28℃、200r/min振荡1h,并用PBS缓冲液()分别稀释至10-2、10-3浓度。取200μL经预处理的样品涂布于分离培养基上。分别置于20、28、37、45℃四组不同培养温度,10-2、10-3两组浓度梯度,在各温度的恒温培养箱中培养21d。根据菌落的质地、形态和颜色、边缘凹凸、是否产生可溶性素及其颜等形态特征,进行初步归类。对每个分离培养基上生长的不同类群单菌落转接于培养基平板上,培养直至获得纯菌落。将初步归类为藻类的藻株接种到其对应的液体培养基中,进行摇瓶培养,200r/min,设置光照和避光两组对照,在各温度下培养14d并观察其生长状况。①菌体/藻体的收取:细菌/真菌的菌体收取:收集新鲜菌体,放入无菌的10mL离心管中,置于液氮中快速冷冻,-80℃备用;藻体收取:在无菌环境下,将三角瓶中的菌液转移到无菌的50mL离心管中,4℃、8000r/min离心10min,去上清,用PBS缓冲液漂洗2次,再次离心去除上清。将收集好藻体的离心管放入液氮中快速冷却,然后置于-80℃备用。②DNA的提取:细菌的基因组提取采用简化的酶小量法提取[19]。提取基因组DNA加入50μL的1×TE,溶解后,-20℃保存。真菌及藻类:采用液氮研磨并配合CTAB法提取[15]。加入50μL的1×TE溶解基因组DNA,放置-20℃保存,备用。③PCR扩增:PCR扩增引物分别用于细菌、真菌及藻类的DNA扩增(表2)。④生物标记基因的确定:使用StarPrepGelExtractionKit胶回收试剂盒进行胶产物回收,胶回收产物利用pMDTM18-TVectorCloningKit进行连接转化,挑取白色克隆子,送上海生工生物工程有限公司测序。(http://eztaxon-e./)和NCBI数据库的BLAST对获得的基因序列进行比对分析,寻找与目的序列相似性最高的已知分类地位的菌/藻株作为比较对象[20-21],,通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树[22-23]。用于检验支持率的重复抽样次数为1000次。表2细菌的16SrRNA、真菌的ITS、,共分离得到细菌92株,真菌31株,藻类3株。去重复后最终获得41株细菌、8株真菌、1株藻,分别对其进行16SrRNA、18SrRNA和ITS的基因序列测定,上传EzBioCloud网站进行比对。结果显示,有41株不同种细菌分布在放线菌门、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)的8个纲11个目18个科18个属,分别为酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)3株、产碱菌属(Alcaligenes)2株、芽胞杆菌属(Bacillus)4株、短波单胞菌属(Brevundimonas)1株、科恩氏菌属(Cohnella)1株、代尔夫特菌属(Delftia)1株、戈登氏菌属(Gordonia)2株、白蚁菌属(Isoptericola)1株、微杆菌属(Microbacterium)13株、微球菌属(us)4株、栖水菌属(Enhydrobacter)1株、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)2株、假单胞菌属(Pseudochrobactrum)1株、嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus)1株、氧化硫杆菌属(Sulfobacillus)1株、冢村氏菌属(Tsukamurella)1株(表4);有8株真菌分布在2个门4个纲5个目5个科5个属,分别为四球菌属(Teratosphaeria)2株、红酵母属(Rhodotorula)1株、青霉属(Penicillium)1株、外瓶霉属(Exophiala)2株、隐球菌属(us)2株(表5);此外,S2样品分离获得1株Galdieria属的红藻,与藻株Galdieriasulphuraria最相近,%。表4原核微生物16SrRNA基因相似性比对结果续表4表5部分菌株ITS基因相似性比对结果以上分离结果显示,通过前期不同培养基、温度和稀释梯度的培养,不同样品表现出了不同的分离效果。其中,样品S1、S2、S8的微生物资源多样性较高,且分离效果较好。在所选择培养基中,改良ISP2培养基和改良9号培养基的培养效果更好,分离得到菌株多样性较为丰富。、ITS或18SrRNA基因序列进行BLAST比对分析,选取与每个种类菌株相似性最大的典型菌株的16SrRNA、ITS或18SrRNA基因序列,,构建系统发育树。结果如图2所示,18个属中的细菌主要包含放线菌门的戈登氏菌属(Gordonia)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(us)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、冢村氏菌属(Tsukamurella)、白蚁菌属(Isoptericola)(图3);其次变形菌门的产碱菌属(Alcaligenes)、代尔夫特菌属(Delftia)、酸硫杆状菌属(Acidithiobacillus)、栖水菌属(Enhydrobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)和假单胞菌属(Pseudochrobactrum)(图4);以及厚壁菌门的芽胞杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(us)、嗜冷芽胞杆菌属(Psychrobacillus)和科恩氏菌属(Cohnella)等;除此之外,分离获得少量真菌(图5)和藻类的纯培养,进一步说明了凡口铅锌矿可培养微生物种类存在多样性。如图6所示,藻SYSUC17050在Galdieria属的分支上稳定,与Galdieriasulphuraria的相似性最高,%,其准确的分类地位需要进一步研究。,constructedbyusingtheNeighbor-Joiningmethodbasedonthe16SrRNAgenesequences